β-葡萄糖苷酶基因过量表达提高Trichoderma reesei纤维素降解活性

摘要

丝状真菌作为低等真核生物具有结构简单、生长迅速、操作简便的优点，同时，又具有真核基因表达和真核蛋白质翻译后修饰加工装置，因此近年来丝状真菌分子生物学逐渐成为现代分子生物学研究的一个热点。瑞氏木霉(Trichoderma reesei)是自然界中广泛分布的腐生性丝状真菌，具有完整的纤维素酶系和半纤维素酶系，用T. reesei作为工业菌株生产分解不同植物材料的酶类，已有多年历史。 T.reesei纤维素酶系包括3种酶，它们协同作用将纤维素降解成寡糖和葡萄糖。其中纤维二糖水解酶和内切葡聚糖酶协同作用降解纤维素生成寡糖，主要是纤维二糖，而β-葡萄糖苷酶继续将纤维二糖降解成葡萄糖。过量纤维二糖的存在对纤维二糖水解酶和内切葡聚糖酶会产生反馈抑制作用，从而降低整个纤维素酶系降解纤维素底物的效率。β-葡萄糖苷酶能够降解纤维二糖，从而可以解除这种反馈抑制。T. reesei中β-葡萄糖苷酶的分泌量很低，因而成为整个纤维素酶系有效降解纤维素底物生成葡萄糖的瓶颈。因此，提高β-葡萄糖苷酶的表达是增强T. reesei降解天然纤维素底物能力的一条重要途经。 本文从T. reesei中克隆得到编码胞外主要β-葡萄糖苷酶的基因bgll，将它克隆到本实验室构建的表达载体pTHP中。pTHP是在cbhl启动子的基础上缺失了包含3个潜在的葡萄糖阻遏位点的-677～-724区域，并将包含CCAAT盒和转录激活因子ACEⅡ结合位点的-620～-820片段以4拷贝的形式插入改造得到。将构建得到的重组质粒pTHB和含有pyrG基因的质粒pAB4-1共转化乳清酸核苷-5-磷酸脱羧酶(pyrG)基因缺陷的T. reesei菌株M23，从无尿嘧啶的平板上挑到96个转化子，通过PCR初步验证得到6株成功转入bgll基因的转化子。对这6株转化子摇瓶发酵并进行酶活测定，筛选得到一株β-葡萄糖苷酶酶活和滤纸酶活都有较大提高的转化子2-6，其β-葡萄糖苷酶酶活和滤纸酶活分别为出发菌株M23的2.8倍和1.48倍。半定量PCR分析结果显示转化子2-6染色体上bgll基因拷贝数增加，证明转入的bgll基因整合到T. reesei染色体上。结果表明由于转入的bgll基因整合到T.resei染色体上提高了BGLI的表达量，从而提高了T. reesei整个纤维素酶系降解天然纤维素底物的能力。本研究进一步证实对丝状真菌工业生产菌株进行遗传操作是菌株改造的一条行之有效的途为了解BGLI在T．reesei细胞内的分泌机制，本文将绿色荧光蛋白gfp基因作为报告基因与bgl1基因融合，把得到的融合片段插入载体pTHP，再将重组质粒pTHR1和pTHR2转入pyrG基因缺陷的T．reesei菌株M23中，从无尿嘧啶的平板上得到约110株转化子，通过PCR初步验证得到7株gfp基因稳定遗传的转化子。将这些转化子接种到以乳糖为碳源的诱导培养基中诱导bgl1/gfp融合基因的表达。经过酶活测定筛选得到一株转化子1-17，其β-葡萄糖苷酶酶活和滤纸酶活分别是出发菌株M23的3.3倍和1.28倍。半定量PCR分析结果表明转化子1-17染色体上的bgl1基因拷贝数增加，证明转入的bgl1基因整合到T．reesei染色体上。对其胞外蛋白进行SDS-PAGE检测，发现一条分子量约为100kD的蛋白条带，推测为BGL/GFP融合蛋白，初步估算其产量为77.7μg/ml。对转化子进行荧光观测未检测到荧光，分析可能是因为以与BGLI融合蛋白形式存在的GFP不能形成正确的结构，因此不能发出荧光，或者由于所发出的荧光较弱而被菌体自发荧光掩盖，因此难以检测。 将bgl1基因3’端加上编码六个组氨酸标签的序列并克隆到载体pTHP中，再将得到的重组质粒pTHB2分别与含有hph基因的质粒pAN7-1和含有amdS基因的质粒p3SR2共转化斜卧青霉 (Penicillium decumbens) JU-A10。分别通过潮霉素抗性和乙酰胺为唯一碳源筛选转化子，共得到约40株转化子，通过PCR 初步验证得到3株bgl1基因稳定遗传的转化子。测定转化子的β-葡萄糖苷酶酶活和滤纸酶活，初步得到1株β-葡萄糖苷酶和滤纸酶活均有提高的转化子，为进一步的研究奠定了基础。

目录

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摘要

缩略词表

第一章绪论

1.1丝状真菌Trichoderma reesei

1.2纤维素酶分子生物学研究进展

1.2.1纤维素酶系的组分

1.2.2纤维素酶降解纤维素的机制

1.2.3纤维素酶分子生物学研究进展

1.3 β-葡萄糖苷酶分子生物学研究进展及应用

1.3.1 β-葡萄糖苷酶研究历史及基本性质

1.3.2 β-葡萄糖苷酶分子生物学研究进展

1.3.3 β-葡萄糖苷酶的应用

1.4绿色荧光蛋白及其应用

1.4.1绿色荧光蛋白的基本性质

1.4.2绿色荧光蛋白作为报告基因的优缺点

1.4.3绿色荧光蛋白在真菌分子生物学研究中的应用

1.5斜卧青霉JU-A10

第二章T.reesei bgl1基因的克隆及过量表达

2.1材料与方法

2.1.1菌株和质粒

2.1.2主要试剂

2.1.3培养基

2.1.4引物设计

2.1.5 T. reesei染色体DNA的提取

2.1.6 bgl1基因的克隆及重组质粒构建

2.1.7 T. reesei的转化及筛选

2.1.8转化子摇瓶发酵及酶活测定

2.1.9转化子bgl1拷贝数的分析

2.2结果与讨论

2.2.1 bgl1基因的克隆及重组质粒的构建

2.2.2 T.reesei的转化及转化子的筛选验证

2.2.3转化子的发酵筛选及酶活测定

2.2.4转化子bgl1基因拷贝数分析

2.3本章小结

第三章β-葡萄糖苷酶基因和绿色荧光蛋白基因的共表达研究

3.1材料与方法

3.1.1菌株和质粒

3.1.2主要试剂及培养基

3.1.3引物设计

3.1.4 bgl1和gfp基因的融合及载体的构建

3.1.5 T. reesei转化及筛选

3.1.6转化子酶活测定

3.1.7转化子bgl1拷贝数的半定量PCR分析

3.1.8转化子蛋白SDS-PAGE检测

3.1.9转化子的荧光检测

3.2结果与讨论

3.2.1 bgl1和gfp基因的融合及载体的构建

3.2.2 T. reesei转化及验证

3.2.3转化子的酶活测定

3.2.4转化子bgl1拷贝数的半定量PCR分析

3.2.5转化子蛋白SDS-PAGE检测

3.2.6转化子的荧光检测

3.3本章小结

第四章bgl1基因在斜卧青霉JU-A10中的表达

4.1材料与方法

4.1.1菌株和质粒

4.1.2主要试剂

4.1.3培养基及培养条件

4.1.4重组质粒的构建

4.1.5斜卧青霉的转化

4.1.6转化子的酶活测定

4.2结果与讨论

4.2.1重组质粒的构建

4.2.2斜卧青霉转化及转化子的筛选验证

4.2.3转化子酶活测定

4.3本章小结

参考文献

致谢