玉米异源染色质导入系的遗传分析和多育性相关基因的分子标记定位

摘要

玉米是重要的粮食兼饲料作物。由于驯化中的“瓶颈效应”和随后的改良选择使得其遗传多样性相对于野生近缘种明显降低，现代玉米育种大多采用少数骨干自交系进行品种改良，导致玉米育种材料的遗传基础狭窄。没有种质的扩增和创新就没有玉米杂种优势水平的突破，因此，种质的拓宽与创新是玉米育种的战略任务，其中开发和利用野生资源是其重要的途径之一。 墨西哥玉米(Zea mays ssp.mexicana，简称ZM)是玉米近缘野生材料，与普通玉米同属玉米种(Zea mays)，为一年生草本植物，生长势强，具有高分蘖性和分枝性、籽粒蛋白质含量高、对多种真菌类疾病免疫或高抗等优点，是玉米育种可利用的优异基因源。掖515为我国骨干自交系，具有农艺性状优良、配合力高、穗行数多等突出优点，但籽粒品质欠佳，高感青枯病、粗缩病和褐斑病。以墨西哥玉米为供体亲本，掖515为受体和轮回亲本，经多代回交和自交获得一批具有特异性状的渐渗系，本工作从中选取了具有多育性，长穗柄，和大果穗三个性状的渐渗材料(分别命名为1＃，10＃，4＃材料)进行细胞学和分子标记鉴定，并进一步对多育性相关基因进行初步定位。 不同渐渗系的细胞学观测从掖515和上述三个渐渗系中，每份材料随机选取5个样本进行染色体核型分析，确定所有材料体细胞染色体数均为2n=20，未发现染色体数目的变化。核型分析表明材料间存在C-分带多态性，表现为带的有无、大小和染色深浅的变化，不同材料间染色体臂比及核型公式变化较明显。掖515的核型公式为2n=16m+4sm。1＃材料及10＃材料型公式分别为2n=14m+6sm、2n=12m+8sm。错材料C-分带结果显示，异染色质深染的带的数目在不同检测样本中有差异，核型不稳定，表明经多代回交自交后得到的4＃渐渗系还没有达到纯和。 GISH分析表明，三个渐渗系均有外源遗传物质渗入。1＃材料共有6个信号点，成对分布于4号、7号染色体的端部及8号染色体亚端部。10＃材料共有6个信号点，成对分布于2号染色体亚端部，和4号、7号染色体的端部。c-分带位置与GISH信号位置高度一致。4＃材料GISH检测出7个信号点，其中6个成对分布于不同染色体端部或亚端部，还有1个信号位点只存在于其中一条6号染色体长臂末端，6号染色体长臂末端的信号不成对分布，与C-分带结果中不同样本带的数目不稳定相互验证，进一步证明4＃材料经过多代回交自交并没有达到纯和。 多育性相关基因的初步定位以掖515(少穗亲本)为母本，1＃渐渗系(多穗亲本)为父本，配制杂交组合，建立含有58个单株的F2代分离群体。采用SSR-BSA(bulked segregant analysis)分析法对F2代分离群体多育性进行鉴定。用筛选出的在1＃材料和掖515间有多态性的130对引物对少穗池、多穗池DNA 进行PCR扩增，其中引物bnlg1779在少穗池中扩增出与亲本掖515一致的条带，在多穗池中扩增出与亲本1＃材料一致的条带。应用Mapmaker Version 3.0软件对分离数据进行连锁分析，利用Kosambi函数将重组率转换成遗传距离，得出SSR标记bnlg1779与多果穗相关基因位点间的遗传距离为13.99cM。在已发表的玉米SSR连锁图谱上，bnlg1779位于3号染色体长臂上。 选取GISH信号所在染色体上的SSR多态性(在掖515与1＃材料间)引物进行分析，结果发现，1＃材料与掖515、ZM相比出现带型多态性，有偏向掖515的、偏向zM的、具有双亲特征带并偏向掖515的、有双亲特征带并偏向ZM的、以及出现新带的。其中偏向zM的和具有双亲特征带说明此染色体有zM的DNA插入。1＃材料的4号染色体被检测15个位点，其中有6个(40％)显示有zM的DNA插入；7号染色体被检测的6个位点中有2个(33.3％)显示有zM的DMA插入；8号染色体被检的9个位点中有2个(22.2％)显示有ZM的DNA插入。并且这些SSR分布与GISH信号相吻合，即细胞学鉴定及分子检测结果基本相符。 本工作对这些渐渗后代进行核型分析和基因组原位杂交鉴定，了解基因组结构的变异程度和异源染色质渐渗片段的分布，为今后相关基因定位和克隆提供了适宜的材料和必要的工作基础。

目录

论文说明：符号说明

声明

第一章前言

1.1玉米的分类、起源与进化

1.1.1玉米的分类

1.1.2玉米的起源

1.1.3玉米的进化

1.2玉米和类玉米的形态特征差异及遗传基础

1.3 Zea mays ssp.mexicana在玉米种质创新中的价值

1.3.1利用野生近缘种创造新种质方法和现状

1.3.2墨西哥玉米在玉米种质创新中的价值

1.4外源遗传物质的鉴定方法及在玉米远缘杂种后代中的应用

1.4.1形态标记

1.4.2细胞学标记

1.4.3 FISH(Fluorescent in situ hybridization，荧光原位杂交)、GISH(Genomic in situ hybridization，基因组原位杂交)

1.4.4分子标记

1.5分子标记技术及SSR-BSA法基因定位

1.5.1分子标记技术

1.5.2 SSR-BSA分析法定位基因

1.6玉米部分农艺性状的相关研究进展

1.6.1玉米多育性研究进展

1.6.2玉米长穗柄研究进展

1.6.3大穗型玉米研究进展

1.7本工作的目的意义

第二章材料和方法

2.1实验材料

2.1.1起始材料

2.1.2三个渐渗系材料的获得

2.1.3F2群体的构建

2.2田间种植和观察统计

2.3多育性的划分

2.4植物总DNA的提取

2.5渐渗系的核型分析

2.5.1材料的处理

2.5.2制片与镜检

2.5.3C-分带

2.5.4核型分析

2.6渐渗系的GISH分析

2.6.1染色体制片

2.6.2探针的标记，检测及封阻DNA的处理

2.6.3杂交

2.6.4杂交信号距着丝粒距离的计算

2.7 SSR引物序列、反应体系和反应条件

2.7.1 SSR引物序列

2.7.2反应体系和反应条件

2.8 PCR反应产物的电泳分析

2.9 BSA(Bulked segregant analysis)法建池

2.10数据统计和分析

第三章结果与分析

3.1三个渐渗系植株的特征

3.2作图群体构建

3.2.1亲本的性状

3.2.2 F2种子出苗率和F2植株的性状

3.3根尖细胞染色体组型分析

3.3.1 ZM与掖515核型比较

3.3.2 1#材料与掖515核型比较

3.3.3 10#材料与掖515核型比较

3.3.4 1#材料与10#材料核型比较

3.3.5 4#材料C-分带检测

3.4三个渐渗系的GISH分析

3.4.1标记探针的点印迹检测

3.4.2三个渐渗系中外源片段的鉴定

3.5多育性相关基因的分子标记及定位

3.5.1标记引物的筛选

3.5.2 SSR标记的连锁分析

3.5.3 1#材料SSR基因定位与GISH检测结果分析比较

3.5.4 1#材料的细胞学鉴定及分子检测比较

3.6掖515与10#材料间引物的初步筛选

第四章讨论

4.1野生种质资源利用价值及策略

4.2染色体上杂交信号的分布

4.3基因组结构重排

4.4玉米多育性利用策略

4.5本论文的创新和不足之处

参考文献

致谢

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