多硫酸化硫酸软骨素的制备、性质及其口服制剂对兔膝骨关节炎的关节保护作用

摘要

随着世界人口进入老龄化，骨关节炎(Osteoarthritis，OA)的患病率不断上升，患病人群日益增多。OA会导致疼痛、残疾，严重影响患者的劳动能力。OA发生时，首先受到损伤的是关节软骨。关节软骨变薄、变性、破坏，软骨下骨硬化、关节间隙狭窄。对OA的治疗目前常用非甾体类抗炎药和多糖类软骨保护剂。多糖类软骨保护剂一般都是肝素类似物，如多硫酸氨基聚糖、多硫酸戊糖钠、多硫酸糖胺聚糖等。它们的作用是维持关节软骨的蛋白多糖含量，刺激软骨细胞合成Ⅱ型胶原及蛋白多糖，从而有助于维持关节软骨完整性。 硫酸软骨素(Chondroitin sulfate，CS)是关节软骨的重要成分，是由重复双糖→4)-β-D-GlcUA-(1→3)-β-D-GalNAc-(1→构成的糖胺聚糖。OA发生时，软骨受到损害，CS含量下降。补充CS能有效缓解症状，减轻炎症区域的肿胀度、下调基质金属蛋白酶-9，减轻OA对软骨的损害；还可能降低发病率、关节温度、痛感。临床上已有CS的复方口服药物或膳食补充剂，用于骨关节炎患者的治疗和保健。而深入研究发现，CS由于糖链上硫酸基位置的不同具有多种异构体。目前使用的CS药物多从动物软骨组织提取，其成分多是4-硫酸软骨素(CSA)和6.硫酸软骨素(CSC)。而在人关节软骨中主要含有的是4，6-二硫酸软骨素(CSE)。体外实验发现，当模拟OA发生时，培养的软骨组织中4，6-双硫酸软骨素含量下降，而有针对性的补充4，6-双硫酸软骨素在低浓度即可刺激软骨基质合成，并抑制蛋白酶合成，具有显著的软骨保护效应。提示硫酸根和其负电荷可能对OA的发病和治疗都非常重要。 为开发针对OA发病机制的特异性的软骨保护剂，本课题采用氯磺酸.甲酰胺磺化法对4-硫酸软骨素进行多硫酸化衍生，制备了含有4,6-双硫酸软骨素结构的多硫酸化硫酸软骨素(Polysulfated chondroitin sulfate，PSCS)，使硫酸软骨素带上更多的负电荷，改变了其构象。由于PSCS是带有大量负电荷的大分子，口服不易吸收，要开发成口服治疗OA的药物，需要制备成带负电荷少、容易吸收的口服制剂。因此我们研究了PSCS的制备、鉴定、剂型及对兔膝OA的药理活性。 1 PSCS的制备、纯化及性质用氯磺酸-甲酰胺磺化法对CS进行多硫酸化，制备PSCS。通过SO42-含量测定和SO42-/COO-比值测定验证磺化结果，SO42-含量从12.76％上升到20.62％，增加了7.76％；SO42-/COO-比值从1.35上升到3.35。产率达78.9％。对产物PSCS进行毛细管电泳分析和高效液相色谱分析，均只出现一个对称尖峰，证明所得产品较纯。并测定了其理化性质，包括糖醛酸含量、氨基己糖含量、绝对分子量、比旋度等。同时测定了PSCS的抗凝效价为40usp/mg。说明PSCS具有一定的抗凝活性。 2.PSCS的结构研究用UV、IR、1H-NMR和13C-NMR分析了PSCS的结构。UV显示，样品不含共轭双键，也不含有蛋白质和核酸等杂质。经与CS红外光谱对比，证实了PSCS具有CS基本母链结构，即含有葡萄糖醛酸与半乳糖胺双糖单位，吡喃糖为β构型。并且在PSCS的IR上出现了硫酸基加在了半乳糖胺6位碳上的特征吸收峰818cm-1，可以判断半乳糖胺6位碳上羟基被硫酸基取代。经过1H-NMR和13C-NMR进一步解析，葡萄糖醛酸的C-2、C-3位都连接上了硫酸基。PSCS主要双糖结构应该为由2，3位硫酸化的葡萄糖醛酸和4，6位O硫酸化的半乳糖胺组成→4)-β-D-GlcUA(2S,3S)-(1→3)-β-D-GalNAc(4S,6S)-(1→。 3.PSCS口服制剂的制备筛选了PSCS-壳聚糖纳米粒剂型的制备条件和方法。其优化条件为：壳聚糖的分子量为5kDa，其浓度为2mg/ml，溶液的pH6.0，加入的PSCS浓度为1mg/ml，体积为壳聚糖溶液的四分之一，滴加速度为2秒/滴，滴加时壳聚糖反应液涡旋转速为600r/min。所得PSCS-壳聚糖纳米粒径在200nm左右，所带电荷为+46mV左右。具有较好的均一性、圆整度和稳定性。 4 PSCS对兔膝骨关节炎的软骨保护作用用兔膝关节腔内注射Ⅱ型胶原酶建立了骨关节炎早期模型。 每日灌胃给PSCS-壳聚糖纳米粒，持续4w。行为学、影像学、病理学检测证实了口服PSCS-壳聚糖纳米粒对兔膝骨关节炎具有一定的疗效。行为学观察可见口服给药PSCS,对骨关节炎的膝疼痛有一定缓解作用。X光片显示，模型组关节面粗糙，关节间隙变窄，有疑似骨赘。而用药组关节面较光滑，关节间隙只是略有变窄，无骨赘。剥离软骨，观察软骨表面：用药组关节软骨表面与模型组相比，软化灶更少，光泽度更好。观察软骨HE染色病理切片，显示PSCS用药组能有效保护软骨表面完整性和深层细胞及结构；经Markin评分，结果显示，模型组为5.76±3.23，PSCS低剂量组为3.98±1.88，PSCS高剂量组为3.32±2.02。PSCS高、低剂量组与模型组相比都具有统计学差异，说明低剂量PSCS即具有一定的缓解软骨退行性变的作用。可以认为PSCS具有一定的软骨保护功能。 检测了兔血清中TNF-α和IL-1β的含量。PSCS低剂量组TNF-α含量为8.98±1.98pg/Ml，与模型组18.76±1.23pg/ml相比具有显著性差异，说明PSCS能有效抑制骨关节炎模型兔血清中TNF-α的增高，且与阳性药物组9.92±1.16pg/ml的效果无统计学差异。IL-1β的含量PSCS组与模型组对比无显著性差异。 本课题取得的主要成果： 成功的制备了纯度较高的多硫酸化硫酸软骨素PSCS，并确认了它含有4，6-双硫酸软骨素结构。 成功的制备了PSCS-壳聚糖纳米粒，并筛选了PSCS-壳聚糖纳米粒制备的最优条件。 将PSCS-壳聚糖纳米粒用于兔膝骨关节炎治疗，证实了PSCS对早期OA具有明显的软骨保护作用。同时也验证了PSCS-壳聚糖纳米粒被机体有效吸收。

目录

论文说明：符号说明

声明

摘要

第一章前言

1 OA的病因、病理及治疗现状

1.1 OA的发病原因

1.2 OA发病的病理改变

1.3 OA的治疗现状

2硫酸软骨素与OA的关系

2.1硫酸软骨素的结构

2.2硫酸软骨素的药理作用研究进展

2.3硫酸软骨素在OA中的作用

3多糖口服给药方式

4本课题拟解决的问题

第二章多硫酸化硫酸软骨的制备、纯化与性质研究

1材料

1.1试剂

1.2仪器

2方法

2.1 PSCS粗品制备

2.2 PSCS脱盐纯化

2.3多硫酸化结果验证

2.4 PSCS纯度鉴定

2.5 PSCS性质测定

3结果

3.1 PSCS粗品制备

3.2 PSCS脱盐纯化

3.3多硫酸化结果验证

3.4 PSCS纯度鉴定

3.5 PSCS性质测定

4讨论

5小结

第三章多硫酸化硫酸软骨素的结构分析

1材料

1.1试剂

1.2仪器

2方法

2.1 CS和PSCS紫外光谱测定

2.2 CS和PSCS红外光谱测定

2.3 CS和PSCS核磁共振图谱测定

3结果

3.1 CS和PSCS紫外光谱测定

3.2 CS和PSCS红外光谱测定

3.3 CS和PSCS核磁共振图谱测定

4讨论

4.1 CS和PSCS紫外光谱测定

4.2 CS和PSCS红外光谱测定

4.3 CS和PSCS核磁共振图谱测定

4.4多硫酸酯化反应机理初探

5小结

第四章多硫酸化硫酸软骨素口服制剂的制备

1材料

1.1试剂

1.2仪器

2方法

2.1 PSCS-壳聚糖纳米粒制备条件筛选

2.2壳聚糖纳米粒的制备

3结果

3.1 PSCS-壳聚糖纳米粒制备条件筛选

3.2壳聚糖纳米粒的制备

4讨论

5小结

第五章多硫酸化硫酸软骨素治疗兔膝骨关节炎的实验研究

1材料

1.1实验动物

1.2试剂及试剂盒

1.3仪器

2方法

2.1实验分组、造模、一般情况观察

2.2 X光片检查膝关节间隙及软骨厚度

2.3膝关节软骨病理学观察

2.4 ELISA检测血清中TNF-α和IL-1β的含量

3结果

3.1动物活动一般情况观察

3.2 X光片检查膝关节间隙及软骨厚度

3.3膝关节软骨病理学观察

3.4 ELISA检测血清中TNF-α和IL-1β的含量

4讨论

4.1选择II型胶原酶诱导兔膝骨关节炎模型的依据

4.2 PSCS治疗兔膝骨关节炎的疗效

4.3 PSCS治疗兔膝骨关节炎的机制

4.4 PSCS药物的安全性

4.5尚待解决的问题

5小结

总结

附图

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表的学术论文