人乳头瘤病毒L1基因在酵母体外翻译系统和原代角质细胞中的表达研究

摘要

为进一步阐明L1基因表达的分子调控机制，我们利用不同分化阶段的小鼠和人的原代角质细胞培养系统和角质细胞体外翻译系统，研究野生型和优化型的HPV6bL1基因随细胞分化的不同转录和翻译特点，试图进一步解析影响L1蛋白在角质细胞中表达的分子调控机制。一、HPV58L1 mRNA在优化的酵母体外翻译系统中的表达研究研究中首先以含有HPV58全基因组的质粒pLink322-HPV58为模板，PCR法扩增HPV58全长型L1基因(LL1)和截短型L1基因(SL1)并连接到真核表达载体pcDNA3.0上，构建出真核重组质粒pcDNA3/LL1、pcDNA3/SL1，经酶切和测序鉴定序列无误。进而利用体外转录试剂盒将pcDNA3/LL1、pcDNA3/SL1中的L1基因体外转录为相应的长短L1 mRNA备用。 为构建酵母体外翻译系统，我们首先制备了酵母的原生质体，然后根据以往报道方法制备啤酒酵母细胞的裂解物，并对制备过程进行了调整和改良。考虑到裂解缓冲液中的镁离子，钾离子浓度会影响外源性mRNA翻译活性，我们针对HPV58L1 mRNA在酵母体外翻译系统中的翻译条件需求对镁离子和钾离子浓度进行了优化。为检测蔗糖对酵母裂解物稳定性的影响，我们在裂解物的制备过程中分别加入不同浓度的蔗糖，并检测其对系统的保护作用。为确定系统优化后翻译效率的提高程度，检测了优化前后酵母系统对HPV58SL1的翻译效率，并比较了与商品化的兔网织红细胞体外翻译系统(RRL)的翻译效率的差异，已知剂量的HPV6bL1蛋白作为信号强度对照。 结果显示，我们构建的体外翻译系统对HPV58L1 mRNA翻译活性良好。镁离子和钾离子对L1蛋白翻译的影响显著，镁离子在裂解缓冲液中浓度为2.2mM时系统翻译活性最高，钾离子的最佳浓度为220mM。加入蔗糖后裂解物的抗冻融能力都有较大的提高，蔗糖的最佳浓度为100mM。对酵母体外翻译系统进行优化后，HPV58SL1 mRNA的翻译效率比RRL系统高出2倍。经计算，优化前1μg SL1mRNA在1毫升反应液中蛋白的产量为20-40μg，优化后为50-70μg，产量提高了1倍。 为进一步研究HPV58长短L1 mRNA在该系统中的翻译特点和差异，我们在优化的酵母体外翻译系统中加入HPV58全长和截短型L1 mRNA，分别进行体外翻译反应。反应过程中改变反应时间、L1 mRNA模板量，加入外源性氨基酸或亮氨酸和酵母的氨基酰tRNA等，观察其对长短L1蛋白合成的影响。结果显示HPV58长短L1 mRNA均可以在酵母系统中获得良好的表达。对比两者的翻译模式，截短型L1翻译启动迅速，10分钟内即达最高表达量；全长型L1翻译启动较慢，反应30分钟后表达量与截短型持平。提示全长型L1蛋白的翻译依赖于反应时间，而截短型L1则不明显。随初始mRNA模板量的增高，两种L1蛋白信号均明显增强，但截短型L1 mRNA翻译水平仍明显高于全长型L1mRNA。外源性的氨基酸的加入仅可以显著提高全长型L1蛋白的翻译，而对截短型L1蛋白的翻译没有影响，提示内源性的氨基酸无法满足全长L1蛋白合成的需要。加入外源性酵母aa-tRNA对两种L1蛋白的翻译均无明显影响，提示系统中内源性的tRNA可充分满足HPV58两种L1 mRNA的表达。 为进一步揭示长短L1蛋白合成效率的差异原因，我们在反应系统中加入不同浓度的外源性的亮氨酸，观察其对两种L1蛋白合成的影响。为检测体外合成的L1蛋白是否可以组成VLP颗粒，将体外翻译的反应液直接进行蔗糖超速离心后透射电镜检测VLP颗粒的形成。Western Blot结果显示，亮氨酸可以提高全长型的L1mRNA的翻译水平，且效应呈亮氨酸剂量依赖性；而截短型L1翻译不受影响。实验结果表明，系统中亮氨酸的缺乏是限制HPV58全长型L1表达的重要因素，这是由于长L1蛋白起始序列中亮氨酸的高频率使用所导致。电镜结果显示全长和截短型L1蛋白均可以组装成VLP颗粒。 综上所述，本部分中我们成功地构建了一种新型的适合HPV58L1蛋白合成的酵母无细胞翻译系统。通过对HPV58L1蛋白合成所需的各成分浓度进行优化，显著提高了系统对L1 mRNA的翻译效率，经优化后首次观察到了系统中HPV58VLP的形成。因而该系统成为继RRL系统后的第二个可进行HPV L1病毒样颗粒组装的体外翻译系统。我们进一步利用该系统探索并揭示了导致长短L1 mRNA翻译差异的原因，并首次观察到了HPV58长短L1蛋白组装的VLP颗粒。HPV/酵母体外翻译系统具有的开放性和高度可操作性等独特优势，因而该系统有望用于1)研究HPV 58 L1蛋白在酵母中表达的影响因素，为提高L1蛋白表达产量、完善VLP酵母基因工程疫苗的生产、开发提供重要的借鉴；2)探讨HPV VLP组装的分子机制，为提高酵母中VLP形成效率，减少其与天然病毒颗粒的免疫原性差异等研究提供一个方便快捷的工具； 3)研究HPVDNA包装的分子机制，为今后探讨长短L1蛋白包装的病毒颗粒的感染力和感染机制的差异以及抗病毒新靶点的筛选等研究提供良好的平台。目前，研究成果已申请国家发明专利一项(公示期)。同类研究尚未见报道。二、HPV6b L1基因在原代角质细胞培养系统中的表达研究为了检测基因密码组成对L1基因在持续分化的角质细胞中表达的影响，我们用HPV6b野生型和优化型的L1真核表达质粒瞬时转染培养一天的鼠角质细胞。转染后的D3，D6，D9，D12分别收集鼠角质细胞提取RNA和蛋白。对细胞固定后进行免疫荧光染色后镜下观察。实时荧光定量PCR检测提取的RNA样品中L1基因的转录水平。Western Blot方法检测L1蛋白的合成情况。 镜下显示：随着转染时间的增长，细胞显示出明显的逐步增强的细胞分化特征，免疫荧光染色结果也显示，角质细胞终末分化的标志性蛋白外皮蛋白(involucrin)在细胞内的表达也随转染时间的延长而明显增强。 实时荧光定量PCR结果显示，转染后角质细胞可以持续转录野生和优化型的L1 mRNA至少12天，而且优化型的L1 mRNA的水平始终显著高于野生型L1，这表明对GC结尾的密码子进行优化可以促进L1基因在KC细胞内的转录。随着细胞的分化，野生型和优化型的L1基因的转录水平都显著下降。Western Blot分析显示，野生型L1蛋白的表达随着细胞转染时间的延长而增强；优化型L1蛋白水平随着细胞转染时间的延长而降低。这表明L1 mRNA的密码子成分组成是调节L1蛋白在KC细胞内持续表达的一个重要因素；HPV L1蛋白的表达是转录后水平调节，同时与细胞的分化水平显著相关。 甲硫氨酸标记的L1蛋白免疫共沉淀实验显示，检测到的L1蛋白的持续表达是由于L1蛋白的持续合成，Ll mRNA的密码子组成是决定L1蛋白持续性合成的重要因素。考虑到人角质细胞是HPV感染的天然宿主细胞，我们检测了HPV6b L1真核表达质粒在原代人角质细胞内的表达情况。所得结果与鼠角质细胞中的结果相似。 为了进一步证实tRNA对L1的翻译调控作用，我们检测了不同分化程度的人或鼠KC中分离的aa-tRNA对体外翻译系统中L1蛋白翻译的影响。结果表明，野生型L1 mRNA倾向于在分化的鼠KC细胞制备的裂解物中进行翻译，而优化型L1mRNA倾向于在低级分化的鼠KC细胞制备的裂解物中进行翻译。这一结果与L1转染的KC细胞中观察到的野生和优化L1蛋白的表达模式相同。这表明低级分化和完全分化的角质细胞中的aa-tRNA组成不同，因而可以不同程度的吻合HPV野生和优化型的L1 mRNA翻译的需要，从而可以调节它们在体外的翻译水平。综上所述，本研究中我们首次利用不同分化阶段的人和鼠原代角质细胞培养系统和体外翻译系统进行了L1蛋白翻译调控机制的研究。研究中首次探索了瞬时转染后的角质细胞中L1基因的转录和翻译时限，揭示了同义密码子的替换效应与细胞分化的密切关系。结果显示密码优化可以改变L1基因在细胞内的表达时效和表达模式，这种差异主要是由于分化阶段不同的角质细胞中的tRNA的组成不同，因而可以不同程度的调节野生型和优化型的L1基因的转录和翻译水平所致。所得结果为进一步阐明PV L1基因表达的分子调控机制提供了重要的实验数据和理论支持，同类研究尚未见报道。

目录

论文说明：符号说明

声明

前言

第一部分：HPV58L1mRNA在酵母体外翻译系统中的表达研究

一、HPV58全长型和截短型L1真核表达质粒的构建与鉴定

材料和方法

二、HPV58全长型和截短型L1mRNA在酵母无细胞培养系统中的表达

材料和方法

实验结果

讨论

第一部分小结

第二部分：HPV6b L1基因在角质细胞培养系统中的表达研究

材料和方法

结果

讨论

第二部分小结

全文小结

论文附图：（一）

论文附图：（二）

参考文献

致谢

攻读博士学位期间发表论文

英文论文1

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