小型猪急性心肌梗死模型血管再生的实验研究

摘要

目的:1.在小鼠角膜模型中，将VEGF、FGF-2和PDGF家族成员(PDGF-AA，PDGF-AB，PDGF-BB)两两组合进行初步筛选，确定有协同促血管生成效应的不同生长因子之间的组合。 2.根据筛选结果进一步探讨最佳组合因子在小型猪心肌梗死模型中的治疗效果及其可能的机制。 1.方法: 1.1 生长因子组合的筛选角膜是没有血管的组织，因此它是研究血管生成的理想模型。我们以hydron聚合体包被蔗糖硫酸铝制作缓释系统，利用该系统包载不同血管生长因子使其成为缓释剂，置入小鼠角膜。不同生长因子单独或联合应用的剂量如下：FGF-2(80 ng)，VEGF(160 ng)，PDGF-AA(160 ng)， PDGF-AB(160 ng)， PDGF-BB(160 ng)，PDGF-AA(160 ng)/FGF-2(80 ng)，PDGF-AB(160 ng)/FGF-2(80 ng)，PDGF-BB(160 ng)/FGF-2(40 ng)， FGF-2(80 ng)/VEGF(160 ng)，PDGF-BB(160 ng)/VEGF(160 ng)。在置入因子后5天后测定每一组动物角膜新生血管的长度和面积。为了观察血管新生的稳定性，在置入因子后第12，24，70天时分别再次测定血管长度和面积，并观察新生血管外形和轮廓的变化，确定有协同促血管生成作用的生长因子的组合，并根据筛选结果在小型猪急性心肌梗死模型中做进一步研究。 1.2 小型猪急性心肌梗死模型的建立以及血管生长因子的导入中国实验用小型猪40只，随机分为4组，每组10只。①PBS对照组，②FGF-2(5μg)治疗组，③PDGF-BB(10μg)治疗组，④FGF-2(5μg)/PDGF-BB(10μg)联合治疗组。所有实验动物的管理均遵循中华人民共和国卫生部动物实验管理条例(N0.55，2001)和山东大学齐鲁医院实验动物管理条例。 动物经过诱导麻醉后建立静脉通路，并静脉注射3％戊巴比妥钠维持麻醉。然后行气管插管，呼吸机机械通气。经前正中线开胸，显露冠状动脉左前降支(LAD)后，于左前降支中远端1/3处用无创针线预结扎(不全部阻断血流)10min，然后完全结扎。 冠状动脉结扎后监测心率和血压的变化，急性心肌梗死模型构建成功的判定指标为：心电监护显示ST段弓背向上抬高持续30min以上，结扎动脉支配区域的心肌变暗变紫，运动减弱。以hydron聚合体包被蔗糖硫酸铝制作缓释系统，利用该系统包载不同血管生长因子使其成为缓释剂，包埋于心包下心肌梗死边缘的缺血区域。 1.3 选择性冠状动脉造影术及评价侧支循环麻醉动物股动脉穿刺成功后，经股动脉将6F导管送入左右冠状动脉行冠状动脉造影，用以证实观察左前降支结扎部位血流完全阻断，并评价LAD分布区的侧支循环。侧支循环指数按Rentrop分级分为0～3级：0级为冠状动脉系统无侧支显影；1级为心外膜下冠状动脉细小分支内有很弱的充盈，但是心外膜主要分支内无显影: 2级为心外膜下冠状动脉主要分支部分充盈；3级为心外膜下冠状动脉主要分支完全充盈。 1.4 应用彩色微粒测定局部心肌血流量在治疗前和治疗后第6周和14周分别应用红色、黄色和蓝色三种不同颜色的彩色微粒(直径 10±2μm， E-Z Trac，Los Angeles，CA)来评估这三个时间点的心肌局部血流量。将5F猪尾导管经股动脉进入左心室，经导管向左心室内注射入5 × 106个彩色微粒(将彩色微粒稀释于10ml生理盐水中)，注射时间为30s，然后用10ml生理盐水冲洗导管。在注射彩色微粒前10s，使用定速抽血泵由股动脉抽取参考血液样本，抽取速率为10ml/min，共90s。血样-20℃保存。根据公司提供的操作步骤回收并计数组织和参考血样中的彩色微粒。根据公式计算心肌局部血流量：Qm=(Cm × Qr)/Cr。其中，Qm是指每克心肌组织的血流量(ml/min/g)，Cm是指每克心肌组织的彩色微粒数，Qr是指参考血样的抽取速度(ml/min)，Cr是指参考血样中的彩色微粒数。 1.5 超声心动图测定左心室整体和局部收缩功能将动物于开胸状态下行心外膜超声检测。在心尖两腔和四腔心切面采以校正的Simpson's方法测定左心室射血分数(LVEF)。在二维灰阶图像上分别测定梗死边缘的缺血区左心室舒张末期(心电图R波峰值处)和收缩末期(心电图T波末端)的室壁厚度，按以下公式计算缺血心肌局部室壁增厚率(wall thickening，WT)：WT=(收缩末室壁厚度-舒张末室壁厚度)/舒张末室壁厚度× 100％ 1.6治疗效果评价心脏缺血区导入生长因子6周后，进行冠状动脉造影和彩色微粒注射分别评价侧支循环和局部心肌血流量；导入生长因子14周后，再次行冠状动脉造影、彩色微粒注射和超声心动图检查来评价侧支循环、心肌灌注以及左室整体和缺血区局部功能。 1.7 免疫组化于第14周实验结束后，麻醉状态下静脉注射氯化钾处死所有实验动物，取出心脏，将左心室LAD结扎远端的缺血心肌分别置于多聚甲醛和液氮中备用，行相关组织学和分子生物学检测。 新生血管的密度测定方法：缺血区组织以多聚甲醛浸泡固定、石蜡包埋，切片厚度5 μm。通过兔多克隆抗体von Willebrand factor(νWF)和小鼠单克隆抗体α-smooth muscle actin(α-SMA)免疫组化标记缺血区心肌的新生毛细血管和小动脉，并用荧光双标来评价新生血管的成熟程度和稳定性。这里我们引入了一个参数：成熟指数(mafuration index)，即被平滑肌包被的新生血管所占所有血管的百分比。 1.8 统计学处理定量数据均以均数±标准误表示，用SPSS 11.5统计软件进行统计分析。在做分析之前，对所有的数据进行正态分布检验。连续变量应用2×2析因设计和重复测量的方差分析。不同时间点连续变量应用重复测量的方差分析，进一步组间两两比较应用LSD或Dunnutt T3(方差不齐时)以及多元方差分析进行。等级资料用非参数检验分析，多组之间的比较用Kruskal-Wallis检验，组间两两比较Mann-Whitney检验。设P＜0.05为有统计学意义。 2.结果: 2.1 小鼠角膜模型血管生长因子的筛选将不同生长因子缓释剂置入角膜第5天时检测结果表明，无论单独应用一种还是联合两种生长因子均可诱导角膜新生血管的形成。与单一因子比较， VEGF/FGF-2和VEGF/PDGF-BB这两种因子组合无显著协同作用。而FGF-2和PDGF家族成员PDGF-AA，PDGF-AB，PDGF-BB联合应用均有显著的协同促血管生成效应。但是到了第70天，联合应用FGF-2和PDGF-AA组诱导的血管几乎完全退化，而FGF-2与PDGF-AB或PDGF-BB协同诱导的新生血管得以维持。因此，我们选择了协同促血管生成作用最强的生长因子组合(FGF-2和PDGF-BB)在小型猪急性心肌梗死模型中作进一步研究。 40只实验用小型猪，第一次手术时死亡5只，其中2只死于麻醉意外，3只于结扎LAD时死于心室颤动。第二次冠状动脉造影时1只动物死于麻醉意外。共有34只小型猪完成了整个实验。 2.2 冠状动脉造影评估侧支指数的变化第一次手术时四组动物的侧支指数均为0，第6周时侧支指数在四组之间的差别有统计学意义(Kruskal-Wallis检验，P=0.026)。进一步组间比较发现，联合应用FGF-2/PDGF-BB组的侧支指数较单独应用FGF-2、PDGF-BB或PBS对照组均显著增高(P值分别为0.037，0.021和0.002)，在结扎的冠状动脉远端形成可显影的侧支血管网络。与基础值相比，单独应用FGF-2治疗也可使缺血区侧支指数增加(P=0.0 18)。单独应用PDGF-BB治疗后虽然侧支指数有增加趋势，但差异未达到统计学意义(P=0.058)。而PBS对照组无明显侧支血管生成。 2.3 彩色微粒测定局部心肌血流量的变化治疗前各组心肌血流量无差别，治疗后第6周和第14周，各组间差别有统计学意义(P＜0.05)。组间比较表明，FGF-2/PDGF-BB联合应用组较单独应用一种生长因子及PBS对照组心肌血流量显著增加(6周，P＜0.01；14周，P＜0.01)。析因设计的方差分析发现FGF-2和PDGF-BB之间有正交互作用(6周，F=7.317，P=0.011；14周，F=4.930，P=0.034)。第14周的结果较第6周时的结果无显著差异。 2.4 左心室整体和局部功能的变化治疗后第14周，FGF-2/PDGF-BB联合治疗组的左室射血分数(LVEF)较对照组显著增高(P=0.034)，但是与单独应用FGF-2或PDGF-BB比较，差别无统计学意义(P值分别为0.10和0.082)。单独应用FGF-2或PDGF-BB较对照组LVEF亦无显著性改变。治疗前各组间缺血区室壁增厚率无差别。 3.结论: (1)联合应用“促血管生成因子”FGF-2和“促动脉生成因子”PDGF-BB有协同的促血管生成作用，能够建立稳定的侧支血管网络，增加心肌血流量，明显改善心功能。 (2)FGF-2和PDGF-BB协同促血管生成机制与血管生成过程中FGFR-1，PDGFR-α和PDGFR-β在心肌微血管中表达上调以及PDGFR和FGFR之间的交互作用有关。这方面的深入研究为将来临床心肌梗死患者的促血管生成治疗奠定基础。

目录

声明

论文一有效血管生长因子组合的筛选和在小型猪急性心肌梗死模型中疗效的研究

中文摘要一

英文摘要一

英文缩写

前言

1材料和方法

1.1研究对象

1.2实验器材、设备及试剂

1.3小型猪急性心肌梗死模型的建立及生长因子的导入

1.4冠状动脉造影

1.5心肌局部血流量测定

1.6超声心动图检查

1.7术后观察及护理

1.8治疗效果的评价

1.9病理学检查

1.10实时定量RT-PCR

1.11统计学处理

2结果

2.1小鼠角膜模型血管生长因子的筛选

2.2侧支循环指数的冠状动脉造影评估

2.3局部心肌血流量的彩色微粒测定

2.4左心室整体和局部功能的超声心动图分析

2.5 HE染色观察形态学改变

2.6 Masson三色染色测定胶原含量

2.7免疫组化染色分析

2.8实时定量PCR分析

3讨论

3.1血管生成的过程和基本概念

3.2治疗性血管生成在缺血性心肌病中的研究现状

3.3治疗性血管生成疗效评价的临床前动物模型选择

3.4主要的促血管生成因子（angiogenic factor）和促动脉生成因子（arteriogenic factor）

3.5促血管生成的基因治疗和蛋白治疗

3.6联合治疗.(Combinatorial therapy)的策略

3.7促血管生成治疗的导入方法

3.10促血管生成治疗的潜在副作用

3.9本研究的创新点和限制性

4结论

附图表

参考文献

论文二缺血和梗死心肌模型心肌应变和应变率跨壁分布与心肌血流量之间定量关系的实验研究

中文摘要二

英文摘要二

英文缩写

前言

1材料和方法

1.1实验动物

1.2仪器设备

1.3动物模型的制备

1.4应变和应变率显像

1.5局部心肌血流量的测定

1.6统计分析

2结果

2.1实验动物一般情况

2.2正常、缺血和梗死节段的心肌应变

2.3正常、缺血和梗死节段的心肌应变率

2.4正常、缺血和梗死节段的心肌血流量

2.5心肌节段血流和应变的相关性

2.6重复性检验

3讨论

3.1左心室功能的评价方法

3.2左心室冠脉循环解剖生理特点

3.3小型猪心肌梗死模型的优势

3.4二维超声心动图在缺血性心脏病中的应用

3.5心肌血流跨壁梯度的评价方法

3.6组织多普勒显像技术

3.7应变与应变率显像技术

3.8心肌纵向应变和应变率的跨壁分布特点

3.9创新点和限制性

4结论

附图表

参考文献

致谢

发表论文

发表论文一

发表论文二