牛外周血中性粒细胞孕酮受体表达及其作用研究

摘要

孕酮（Progesterone，P）是诱发牛围产期免疫抑制的关键激素之一，其浓度的动态变化在外周血中性粒细胞（polymorphonuclear neutrophil，PMN）的分布、数量、状态以及功能改变过程中发挥重要作用，但P诱导牛外周PMN的信号机制，特别是受体介导的信号转导机制仍有待阐释。本试验以阉牛外周血PMN为研究对象，分别采用qPCR、western blot方法，探讨不同浓度P在体内注射和体外诱导条件下，P核受体、膜受体和雌激素核受体、膜受体以及免疫活性分子TLR2、TLR4、及NF-κB等在基因转录和蛋白表达水平上的变化，从而为确定牛PMN的P受体表达状况、揭示牛外周血P调节PMN免疫功能的基因组信号途径和非基因组信号途径的特征、阐释牛外周血P浓度与PMN免疫活性的内在联系提供新证据。试验结果显示：
　　1、受体表达：
　　（1）nPRs表达：牛PMN在基因转录和蛋白水平上表达nPRs；低浓度P刺激PRB表达，加入核受体抑制剂RU486和LPS后均表现出下调趋势；高浓度P上调PRB的表达，且RU486对PRB的表达无显著性影响，在LPS引起的炎症反应中PRB表达下调。
　　（2）mPRs（mPRα、mPRβ、PGRMC1）表达：牛PMN在基因转录和蛋白水平上表达mPRs；低浓度P下调mPRα和PGRMC1的表达，上调mPRβ表达在2h处达到峰值。在RU486和LPS作用下以上三种膜受体表达趋势无明显变化；高浓度P上调mPRβ和PGRMC1，抑制mPRα表达且在RU486和LPS作用下抑制作用逐渐解除。
　　（3）ERs表达：低浓度P上调ERα和GPR30，在加入RU486后均表现出显著的下调趋势。
　　2、细胞活性信号通路的信号表达：
　　（1）MyD88：高低浓度P均上调MyD88，且在30min后达到峰值水平，低浓度P在RU486作用下抑制MyD88表达，高浓度P时无影响。
　　（2）TLR2、TLR4：高低浓度P均下调TLR2，上调TLR4表达，且低浓度时RU486和LPS对二者的表达影响显著，均表现出抑制作用。
　　（3）NF-κB：高浓度P抑制NF-κB表达，在RU486和LPS作用下抑制作用解除；低浓度P在30min后解除对NF-κB表达的抑制作用，RU486和LPS对其表达均无显著影响。
　　本试验证实了牛外周PMN在基因和蛋白水平上存在nPRs、mPRs以及E受体的表达，并起到交叉介导P的非基因组效应。孕酮是通过PR介导的基因组途径以及上调或下调其膜受体引发快速的非基因组信号传导来发挥其抗炎作用；同时某些免疫调节作用可能是通过上调ERα和GPR30而非通过PR信号所传导，但仍需要进一步的实验来证明。

目录

缩略语表

1 引言

1.1 PMN的生物学特性及在故有免疫中的作用

1.2孕酮的免疫调节功能

1.3孕酮特异性受体表达及其信号介导作用

1.4 Toll样受体

1.5雌激素及其受体

1.6本课题研究目的与意义

2材料与方法

2.1试验动物

2.2主要试剂

2.3耗材及仪器

2.4试验方法

2.5统计学分析

3结果与分析

3.1 PMN的分离与观察

3.2总RNA提取结果

3.3基因与蛋白表达检测结果

4讨论

5结论

参考文献

附录

致谢

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