蓖麻酵母单杂交cDNA文库构建及Skn-1结合蛋白的筛选研究

摘要

蓖麻(Ricinus communis L.)是重要的油料作物，蓖麻油是理想的替代化石燃料的能源。为提高蓖麻种子含油量，应用生物技术在转录水平上研究是研究热点。WRKY是植物体内一类重要的转录因子，其介入植物诸多进程，在转录水平上与顺式作用元件互作调控基因表达。Skn-1 motif是胚乳表达元件，在植物中被发现，是启动子区常见的元件。本试验以蓖麻为试验材料，应用酵母单杂交技术筛选蓖麻油脂积累相关基因启动子区Skn-1序列相互作用的转录因子——RcWRKY48。生物信息学分析蛋白质性质及结构，并构建pETM-30-RcWRKY48表达载体，诱导、表达、纯化得到纯蛋白。从转录水平探索Skn-1与转录因子RcWRKY48相互作用调控基因表达，为深入研究调控蓖麻油脂积累机制提供理论与实践基础。结果显示： 1、构建用于酵母单杂交筛选的蓖麻cDNA文库——pGADT7-50 DAP，库容量为2.5×5×106 CFU=1.25×107 CFU，文库库容大于1.25×106CFU，平均插入片段1.5 Kbp左右，阳性率为100%，文库指标合格。 2、用plantCARE对FAH12基因ATG上游1100 bp的启动子序列进行顺式元件预测，结果显示该序列包含真核生物启动子区具有的常规保守序列，如：TATA-box、CAAT-box、W-box、Box 4和Box-W1等，还含有Sp1、G-Box、HSE、GA-motif、ARE等胁迫应答元件和胚乳表达元件Skn-1 motif。 3、基于Skn-1 motif序列，人工合成诱饵序列，构建pHIS2-RcSkn-1诱饵载体，与文库质粒共转化酵母菌Y187中，筛选得到与Skn-1相互作用的蛋白质RcWRKY48。生物信息学分析此蛋白为非分泌蛋白，无跨膜结构域。同源性比对，构建了系统发育树，与橡胶聚类到一起。应用在线软件预测了蛋白的二级结构，发现蛋白多数为无规则卷曲，三级结构预测发现含有锌指结构。 4、成功完成了原核表达载体pETM-30-RcWRKY48的构建，并将表达载体转入BL21(DE3)表达菌株内过夜诱导，蛋白大量表达。对RcWRKY48蛋白进行His亲和纯化，离子交换和分子筛层析纯化，获得高纯度的蛋白。

目录

缩 略 语 表

1 引言

1.1 蓖麻是重要的生物能源

1.2 蓖麻种子油脂积累途径

1.3 高等植物中转录因子与DNA相互作用研究

1.4 WRKY类转录因子研究进展

1.5 原核蛋白表达系统

1.6 本研究课题的目的与意义

2 试验材料与方法

2.1 试验材料

2.2 试验方法

3 结果与分析

3.1 蓖麻cDNA文库构建结果分析

3.2 诱饵质粒载体构建结果

3.3 Skn-1结合蛋白的筛选

3.4 RcWRKY48生物信息学分析结果

3.5 RcWRKY48蛋白诱导、表达和纯化结果

4 结果讨论

4.1 蓖麻cDNA文库构建分析

4.2 酵母单杂交分析

4.3 原核表达分析

5 结论

参考文献

致谢

作 者 简 介

附 件1

附 件2

附 件3

附 件4

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