组织靶向肝素-SOD及季铵化壳聚糖-SOD结合物的制备及其对ROS诱导损伤的作用与机制研究

摘要

活性氧族（reactive oxygen species，ROS），例如超氧阴离子自由基（（））和H2O2等都能造成机体氧化性应激反应，成为许多疾病比如肝损伤、肺损伤的诱导因子。超氧化物歧化酶（SOD）能够分解（），从而可防御由于氧化应激反应造成的损伤。然而体内试验却表明，SOD在抗炎、抗纤维化中发挥的作用不够理想，需要的剂量较大。造成SOD在动物实验和临床试验疗效不理想的原因是由于SOD不理想的药代动力学特点，即体内半衰期短（t1/2大约6min）。为了改善SOD的药代动力学性质，提高SOD的作用效果，本文设计研究了具有长效和组织或者细胞靶向性SOD，即用阴离子多糖肝素修饰的SOD（Hep-SOD）和用阳离子多糖N，N，N-三甲基季铵化壳聚糖（TMC）修饰的SOD（TMC-SOD），及它们的理化与生物学性质和对ROS引起的损伤的作用与机制。 本论文的主要研究内容与结果如下。 1 Hep-SOD与TMC-SOD的制备 采用高碘酸钠氧化法活化肝素，用活化的肝素在pH9.5、0.3 mol/L碳酸盐溶液中对SOD进行化学修饰，反应产物通过电泳鉴定。对该修饰反应液进行预处理后，用DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换柱层析进行修饰酶的分级分离，制备Hep-SOD结合物。 EDC（1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺）缩合法制备TMC-SOD。为增加壳聚糖的水溶性和阳电荷性质，先将壳聚糖用H2O2法降解，再通过N-位三甲基化，得到TMC。TMC在缩合剂EDC的存在下对SOD进行修饰，得到TMC-SOD，修饰反应液进行预处理后，用DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换柱层析进行修饰酶的分级分离得到TMC-SOD结合物。 SOD活性测定结果表明，天然SOD、TMC-SOD以及Hep-SOD酶活分别为3250、2830和2770 U/mg。采用MTT法测定证实，SOD的两种结合物均无细胞毒性。 2 Hep-SOD、TMC-SOD的二级结构分析 采用圆二色谱法（CD）对SOD及其修饰物的二级结构进行研究，并比较其差别。结果显示，在溶液状态SOD与其两种结合物的CD图谱略有差异。具体来讲，Hep-SOD比未修饰的SOD分子结构中α-helix比例增加（24.50％vs23.50％），而β-sheet的含量降低（48.3％ vs49.8％），同时，Random. Coil成分比例均略有下降（30.80％ vs31.90％）。研究表明，SOD经过TCM修饰以后在二级结构上也发生了一定的变化，主要表现在α-helix降低（20.70％ vs23.50％）；β-构象的含量升高（53.7％ vs49.8％），同时，Random. Coil的含量升高（37.90％ vs31.90％）。但总体而言，SOD经过修饰前后对二级结构的影响都不大，这与修饰前后对SOD酶活的影响不大一致。 3 SOD结合物对巨噬细胞的靶向性研究 3.1 SOD结合物对细胞内SOD酶活、总抗氧能力（T-AOC）、超氧阴离子释放的影响 本研究考察了SOD结合物对淀粉诱导的小鼠腹腔巨噬细胞内SOD酶活力和T-AOC以及对抑制（）释放的影响。结果显示，正常小鼠腹腔巨噬细胞内SOD酶活性为48.34±5.39 U/mg蛋白，巨噬细胞与各用药组共同孵育以后细胞内酶活性均升高，其中SOD组细胞内酶活升高到62.92±6.00 U/mg蛋白，与正常细胞内酶活相比差异不显著（P>0.5），而Hep-SOD组和TMC-SOD组细胞内酶活性升高均非常显著，分别达到162.2±7.20和408.04±15.91 U/mg蛋白，与正常细胞内酶活相比具有显著性差异（P<0.01）。结果还表明，正常小鼠腹腔巨噬细胞内T-AOC为9.50±1.49 U/mg蛋白，巨噬细胞与各用药组共同孵育以后细胞T-AOC均升高，SOD组细胞内T-AOC升高到11.89±2.28 U/mg蛋白，与正常细胞内T-AOC相比差异不显著（P>0.5），而Hep-SOD组和TMC-SOD组细胞内T-AOC升高非常显著，分别达到32.39±2.94 U/mg蛋白和71.36±5.35 U/mg蛋白（P<0.01）。研究显示，Hep-SOD和TMC-SOD均能够抑制巨噬细胞（）的释放，影响趋势与各用药组对细胞内SOD酶活性的影响变化趋势基本一致，TMC-SOD用药组的抑制作用显著高于其他用药组。 3.2流式细胞技术检测SOD结合物对巨噬细胞的结合能力 本研究借助流式细胞仪检测考察SOD及其两种结合物对巨噬细胞的结合能力。FITC标记的SOD、Hep-SOD以及TMC-SOD与小鼠腹腔巨噬细胞共同孵育，结果表明，TMC-SOD对细胞的结合能力最强，其次是Hep-SOD，阳性率分别为95.36％和29.2％，而SOD孵育组阳性率只有22％；当延长孵育时间达到2h，阳性率均升高，其中SOD、Hep-SOD组分别升高到37.64％和51.81％。 3.3激光共聚焦显微镜技术研究SOD及其修饰物巨噬细胞内分布 FITC标记的SOD及SOD衍生物与巨噬细胞共孵育1 h后，SOD组的荧光信号较弱，而Hep-SOD组和TMC-SOD组的荧光信号与SOD组相比有不同程度的增强，其中，Hep-SOD组荧光略强于SOD组。FITC标记的SOD及SOD衍生物与巨噬细胞共孵育2h后，荧光强度均比1h时的相同药物组有不同程度的增强，且两个修饰物组均表现出比SOD组更强的荧光强度。 4 Hep-SOD结合物对CCl4诱导的急性肝损伤和肝纤维化的防治作用 4.1 Hep-SOD结合物对CCl4诱导的急性肝损伤的作用 本研究采用CCl4腹腔注射诱导小鼠急性肝损伤，立即尾静脉注射给药。用药24 h取血测定血清LDH、GSH和GOT/GPT活性；取肝组织测定MDA含量。结果显示，Hep-SOD以及Hep+SOD组转氨酶浓度均低于模型组，但高于正常对照组。结果还显示腹腔注射CCl4不仅导致血液GOT/GPT、LDH以及肝组织MDA浓度升高，还同时降低GSH的浓度。研究发现，尾静脉注射Hep-SOD能够显著降低LDH，同时增高GSH的浓度。各生化指标显示，与天然SOD相比，Hep-SOD保肝作用更为显著，Hep-SOD对CCl4诱导的急性坏死性肝损伤具有很理想的预防和保护作用。肝素用药组在本实验中没发现有明显的疗效。 4.2 Hep-SOD结合物对CCl4诱导的肝纤维化的防治作用 本研究采用CCl4腹腔注射，每周2次，连续12周诱导小鼠肝纤维化，在CCl4注射后立即腹腔注射给药，最后一次用药24 h后眼球取血处死动物，进行以下实验。 （1）羟脯氨酸测定 （2）肝脏病理学检测 （3）Hep-SOD对小鼠肝组织相关mRNA转录水平的影响 （4）Hep-SOD对小鼠肝组织TGF-β1蛋白表达水平的影响 5 TMC-SOD结合物对CCl4诱导的急性肝损伤和肝纤维化的防治作用 5.1 TMC-SOD对急性肝损伤的保护作用 采用对CCl4注射的小鼠尾静脉注射TMC-SOD。用药后24 h取血处死，测定血液生化指标GOT/GPT、GSH、LDH以及肝组织中MDA含量。结果显示，CCl4诱导急性肝损伤通过降低GSH水平、提高脂质过氧化来改变组织氧化还原状态。而上述变化在TMC-SOD用药组以及TMC+SOD用药组均得到部分抑制。各生化指标显示，与其他用药组相比，TMC-SOD组对急性肝损伤的改善作用最显著。 5.2 TMC-SOD对肝纤维化的保护作用 本研究采用TMC-SOD和CCl4同时腹腔注射小鼠，每周两次，连续12周。组织病理学以及羟脯氨酸含量测定均表明TMC-SOD能够有效防治肝纤维化。本研究还采用RT-PCR测定TGF-β1、MMP-2以及collagen-I等的mRNA。测定结果显示，CCl4连续注射12周能够使上述mRNA显著升高，而TMC-SOD用药组能够有效降低上述mRNA水平。 本研究取得的主要结论: （1）成功制备分离得到了Hep-SOD和TMC-SOD两种多糖结合物，并借助CD技术对两种结合物二级结构进行了分析，发现该制备过程对SOD二级结构影响不大。 （2）聚阴离子黏多糖--肝素以及聚阳离子黏多糖--TMC是较理想的巨噬细胞靶向性修饰剂，其中TMC的靶向性修饰效果更好。 （3）Hep-SOD通过升高GSH的浓度和降低TGF-β1的表达，能够防治CCl4造成的急性肝损伤和肝纤维化，该防治作用可能是结合物的抗氧化作用和抗炎作用共同作用的结果。 （4）TMC-SOD结合物防治急性肝损伤和肝纤维化作用显著。TMC-SOD将有望成为治疗由于氧化应激作用导致的肝纤维化和急性肝损伤的有效药物。 （5）与天然SOD相比，TMC-SOD以及Hep-SOD的血液半衰期显著延长；TMC-SOD和Hep-SOD均对肺脏有靶向性。 （6）SOD的肝素或者TMC化学修饰物能够有效治疗自由基介导的炎症反应；TMC-SOD以及Hep-SOD都有望成为防治ROS导致的组织损伤的理想药物。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略语表

声明

第一章前言

1活性氧族(ROS)

2超氧化物歧化酶

2.1超氧化物歧化酶的研究与应用

2.2超氧化物歧化酶基因及其克隆、表达和调控

2.3超氧化物歧化酶的制备

2.4超氧化物歧化酶在临床上的应用

2.5运用基因敲除和转基因动物模型研究超氧化物歧化酶放射防护作用

2.6超氧化物歧化酶非肽模拟物的放射防护作用

3超氧化物歧化酶的化学修饰

3.1超氧化物歧化酶化学修饰的概况

3.2超氧化物歧化酶化学修饰后的特性变化

3.3当前超氧化物歧化酶化学修饰还待解决的问题

3.4利用功能性材料实现超氧化物歧化酶的靶向性修饰

3.5设计超氧化物歧化酶化学修饰的注意点

3.6酶化学修饰方法的选择

3.7对超氧化物歧化酶特殊氨基酸残基侧链基团的化学修饰

3.8超氧化物歧化酶化学修饰展望

4本课题已有的研究基础

5本课题拟解决的问题

第二章Hep-SOD结合物的制备及二级结构的研究

1材料

1.1试剂

1.2仪器

2方法

2.1超氧化物歧化酶蛋白含量的测定

2.2超氧化物歧化酶活性测定

2.3酶蛋白自由氨基修饰率的测定

2.4 Hep-SOD结合物的制备

2.5 Hep-SOD的分离

2.6 Hep-SOD分级产品的理化性质

2.7 Hep-SOD结合物的二级结构的研究

3结果

3.1肝素对超氧化物歧化酶的化学修饰

3.2 Hep-SOD的分级分离

3.3 Hep-SOD分级产品的理化性质

3.4 Hep-SOD和超氧化物歧化酶的二级结构CD谱分析

4讨论

4.1肝素对超氧化物歧化酶的修饰

4.2 Hep-SOD的分级分离

4.3 CD谱对二级结构的分析

5结论

第三章低分子季铵化壳聚糖对超氧化物歧化酶的化学修饰

1材料

1.1试剂

1.2仪器

2方法

2.1超氧化物歧化酶酶活测定

2.2等电聚焦聚丙烯酰胺凝胶电泳比较修饰率

2.3 TMC的制备

2.4 TMC对超氧化物歧化酶的化学修饰

2.5非共价结合作用的考察

2.6 TMC-SOD的分级分离

2.7 TMC-SOD分级产品的初步筛选

2.8 TMC-SOD结合物二级结构的研究

3结果

3.1 TMC的制备

3.2修饰反应IEF-PAGE电泳

3.3非共价结合作用的考察O

3.4修饰产物TMC-SOD的层析分离

3.5层析分级产物TMC-SOD的IEF-PAGE电泳鉴定

3.6 TMC-SOD分级分离产品中TMC与超氧化物歧化酶比值

3.7 TMC-SOD分级分离产品酶比活比较

3.8 TMC-SOD结合物的二级结构研究

4讨论

4.1 TMC的制备

4.2 TMC对超氧化物歧化酶的修饰

4.3 TMC-SOD的分级分离

4.4 TMC-SOD二级结构的变化

4.5 TMC-SOD分级产品的初步筛选

5结论

第四章超氧化物歧化酶及其衍生物对巨噬细胞的亲和力以及对辐射诱导的炎症细胞因子的表达作用研究

1材料

1.1试剂

1.2动物和细胞株

1.3仪器

2方法

2.1小鼠腹腔巨噬细胞的制备

2.2孵育细胞内超氧化物歧化酶活性和总抗氧能力(T-AOC)的测定

2.3秋水仙素对孵育细胞内超氧化物歧化酶活性和T-AOC的影响

2.4孵育细胞抑制超氧阴离子释放能力的测定

2.5流式细胞仪检测超氧化物歧化酶及其结合物对巨噬细胞的结合能力

2.6超氧化物歧化酶及其衍生物对辐射诱导的炎症细胞因子表达的影响

2.7 MTT法测定超氧化物歧化酶结合物对细胞的毒性作用

2.8数据处理

3结果

3.1超氧化物歧化酶结合物对细胞内酶活性的影响

3.2 SOD结合物对孵育细胞T-AOC的影响

3.3超氧化物歧化酶结合物对孵育细胞抑制超氧阴离子释放能力的作用

3.4流式细胞检测超氧化物歧化酶结合物对巨噬细胞结合能力的强弱

3.5激光共聚焦显微镜测定超氧化物歧化酶及其衍生物在细胞内的分布

3.6超氧化物歧化酶结合物对辐射诱导的炎症细胞因子表达的影响

3.7超氧化物歧化酶结合物对巨噬细胞增殖的影响

4讨论

4.1两种结合物对巨噬细胞亲和能力的研究

4.2超氧化物歧化酶结合物对炎症细胞因子的表达影响

4.3两种结合物对巨噬细胞的增殖性研究

5小结

第五章Hep—SOD结合物对急性肝损伤和肝纤维化的防治作用

1材料

1.1试剂

1.2动物

1.3仪器

2方法

2.1 Hep-SOD对CCl4诱导的急性肝损伤的保护作用研究

2.2 Hep-SOD对CCl4诱导的肝纤维化的保护作用研究

2.3数据处理

3结果

3.1对急性肝损伤的保护作用

3.2对肝纤维化的保护作用

4讨论

4.1 Hep-SOD结合物对CCl4诱导的急性肝损伤的保护作用

4.2 Hep-SOD结合物对CCl4诱导的肝纤维化的防治作用

第六章 TMC-SOD对CLl4诱导的急性肝损伤和肝纤维化的保护作用

1材料

1.1试剂

1.2动物

1.3仪器

2方法

2.1 TMC-SOD对CCl4诱导的急性肝损伤的保护作用研究

2.2 TMC-SOD对CCl4诱导的肝纤维化的保护作用研究

2.3数据处理

3结果

3.1对急性肝损伤的保护作用

3.2对肝纤维化的保护作用

3.3 RT-PCR检测结果

3.4 Western blotting检测结果

4讨论

第七章超氧化物歧化酶修饰产物在小鼠体内的药代动力学研究

1材料

1.1试剂

1.2仪器

1.3动物

2方法

2.1超氧化物歧化酶，Hep-SOD和TMC-SOD的放射标记

2.2碘标试药在小鼠血液半衰期和体内分布

2.3数据统计分析

3结果

3.1超氧化物歧化酶及其衍生物125I标记结果

3.2超氧化物歧化酶结合物在小鼠体内的药物代谢动力学

3.3超氧化物歧化酶及其结合物在正常小鼠体内分布

4讨论

5结论

总结与展望

1论文主要结论

2展望

参考文献

发表论文一

发表论文二

发表论文三

发表论文四

致谢

博士期间撰写的论文