哮喘小鼠肺组织血管生成与FIZZ1，VEGF，HIF-1α表达相关性及干预治疗的研究

摘要

气道重塑是支气管哮喘（简称哮喘）的特征性病理改变，表现为气道平滑肌增生肥大，粘液腺增多，网状基底膜增厚，此外还表现为气道粘膜下层和（或）粘膜固有层血管数目和血管面积的增加，此现象称为“血管生成”。血管生成是支气管哮喘气道重塑的重要组成部分，伴随气道重塑发生发展。新生血管是炎症细胞进入气道壁的门户，促进气道壁增厚，进而引起气流阻塞和气道高反应性。越来越多的研究表明，哮喘患者肺组织的血管数目和血管面积较正常人群显著增加，血管生成在支气管哮喘的进展中发挥重要作用。近年来，对于哮喘患者血管生成的组织病理学有了进一步的了解，但是对血管生成机制的认识还很欠缺。 哮喘肺组织血管生成是气道在低氧条件下炎症反应反复刺激的结果，细胞因子在其中发挥着重要作用。炎症区域分子-1（found in inflammatoryzone1，FIZZ1）又称为抵抗素样分子α（resistin-like moleculea，RELMα）是近年来发现的与肺部疾病密切相关的炎症因子。FIZZ1和Ym-1同为选择性活化巨噬细胞的重要标记物。炎症反应时期，FIZZ1蛋白家族在肺组织表达水平显著增加。FIZZ1刺激肺血管平滑肌细胞和肺内皮细胞增殖，促进血管内皮生长因子（vascularendothelial cell growth factor，VEGF）表达增高。VEGF是血管生长关键的影响因子，增加血管通透性，并直接刺激血管内皮细胞的分化增殖和迁移，促进血管构建及生长。VEGF在低氧环境下的表达受缺氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor1α，HIF-1α）的调控。HIF-1α是存在于哺乳动物体内的氧特异感受器，在缺氧状态下的信号转导中有重要作用。HIF-1α促进下游基因VEGF的表达，增加血管生成，满足机体代谢需要。同时，血管生成供给炎症细胞营养，促进炎症反应发展。研究提示，FIZZ1、HIF-1α和VEGF在血管生成中有重要作用，目前哮喘肺组织血管生成的研究中，上述因子的作用鲜有报导。 吸入型糖皮质激素是控制哮喘的一线用药，可减轻气道炎症反应，有抑制血管生成的报道。作为治疗哮喘的激素类药物之一，布地奈德影响哮喘血管生成的作用机制研究很少。本研究通过卵清蛋白致敏和激发小鼠建立哮喘模型，观察哮喘小鼠肺组织的血管生成变化，以及细胞因子（FIZZ1和VEGF）在哮喘肺组织血管生成中的作用；并通过雾化吸入布地奈德治疗慢性哮喘小鼠，观察糖皮质激素对肺组织血管生成的影响和HIF-1α、VEGF蛋白表达的变化，探讨布地奈德对哮喘小鼠血管生成的作用机制。 第一部分：炎症区域分子-1参与哮喘小鼠肺组织血管生成 目的： 血管生成是支气管哮喘气道重塑的重要组成部分，伴随气道重塑发生发展。血管生成在哮喘的进展中发挥重要作用，其相关机制成为新近研究的热点。FIZZ1是近年发现的与肺部疾病密切相关的炎症因子。FIZZ1刺激肺血管平滑肌细胞和肺内皮细胞的增殖，促进VEGF表达。VEGF是血管生长的关键因子，增加血管通透性，并直接刺激血管内皮细胞的分化增殖和迁移，促进血管的构建及生长。目前尚未见到有关FIZZ1在哮喘小鼠肺组织血管生成中作用及机制的相关报道。本实验中，我们建立哮喘小鼠模型，旨在观察肺组织血管生成的变化，探讨FIZZ1、VEGF蛋白与血管生成的相关性。 方法： 1.实验动物及动物分组： 雌性BALB/c小鼠，体重20g-24g，6-8周龄。小鼠随机分为6组（n=10）：A组：哮喘模型卵清蛋白（ovalbumin，OVA）雾化刺激7天组；B组：哮喘模型OVA雾化刺激14天组；C组：哮喘模型OVA雾化刺激28天组；D组：健康对照磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）雾化刺激7天组；E组：健康对照PBS雾化刺激14天组；F组：健康对照PBS雾化刺激28天组。D组、E组和F组分别为A组、B组和C组的健康对照。 2.建立哮喘小鼠模型： A、B、C组小鼠第1天和第14天分别腹腔注射0.2ml OVA致敏剂溶液，第21天开始予OVA雾化刺激，每日30分钟，建立哮喘小鼠模型。健康对照组以PBS代替OVA致敏并雾化刺激。 3.肺组织标本留取： 雾化刺激7天后，麻醉处死A组和D组小鼠；雾化刺激14天后，处死B组和E组小鼠；雾化刺激28天后，处死C组和F组小鼠；留取肺组织，置于4％多聚甲醛中固定。 4.苏木素&伊红染色观察肺组织病理学改变。 5.免疫组织化学染色，观察血管生成和FIZZ1、VEGF蛋白的表达。 6.统计学分析。 结论： 哮喘小鼠肺组织血管生成增多，FIZZ1和VEGF表达增加，FIZZ1调控VEGF表达增高是哮喘小鼠肺组织血管生成增多的可能机制。 第二部分：雾化吸入布地奈德对慢性哮喘小鼠缺氧诱导因子-1α及血管内皮生长因子表达的影响 目的： 血管生成在慢性哮喘的进展中发挥重要作用，能增加炎症细胞浸润从而促进气道壁增厚，引起气道高反应性。目前，肺组织血管生成机制的研究还处于早期阶段。HIF-1α在缺氧状态下的信号转导中有重要作用，能刺激下游基因VEGF的表达，增加血管生成。VEGF是血管生成和血管渗透性的基本调节因子，在血管生长过程中具有重要作用。吸入型糖皮质激素（布地奈德）是控制哮喘的一线药物。目前有关糖皮质激素影响哮喘血管生成机制的研究很少，尚未见到有关布地奈德对慢性哮喘小鼠肺组织HIF-1α和VEGF表达影响的报道。本研究旨在建立慢性哮喘小鼠模型，探讨布地奈德影响哮喘肺组织血管生成的作用机制。 方法： 1.实验动物及分组： 雌性BALB/c小鼠，30只，体重20g-24g，6-8周龄。将小鼠随机分为3组（n=10）：哮喘模型组，治疗组和健康对照组。 2.建立慢性哮喘小鼠模型： 哮喘模型组小鼠第1天和第14天分别腹腔注射0.2mlOVA致敏剂溶液，第21天开始至实验结束OVA雾化刺激，每日30分钟，建立慢性哮喘小鼠模型；健康对照组以PBS代替OVA致敏和雾化刺激；治疗组小鼠造模过程同哮喘模型组，第28天开始每日雾化吸入布地奈德150μg/㎡，1小时后再予OVA雾化刺激维持哮喘状态。 3.肺组织标本留取： 治疗20周后，麻醉处死哮喘模型组、治疗组和健康对照组小鼠，留取肺组织，部分置于4％多聚甲醛固定，部分置于液氮中保存。 4.苏木素&伊红染色观察肺组织病理学改变。 5.Masson三色染色法观察肺组织胶原纤维生成情况。 6.免疫组织化学染色，观察肺组织血管生成、HIF-1α和VEGF蛋白的表达。 7.蛋白印记分析（Western blot）技术检测小鼠肺组织HIF-1α和VEGF蛋白的表达。 8.统计学分析。 结论： 雾化吸入布地奈德能抑制慢性哮喘小鼠血管生成，降低HIF-1α和VEGF的表达。血管面积与HIF-1α、VEGF蛋白表达均呈正相关，提示HIF-1α/VEGF通路是布地奈德抑制慢性哮喘小鼠肺组织血管生成的可能机制。 第三部分条件免疫反应对慢性哮喘小鼠的作用研究 目的： 条件免疫反应（conditioned immune response，CIR）又称条件反射性免疫反应，是根据经典巴甫洛夫条件反射的训练方式，将新异刺激与能够引起机体免疫反应的非条件刺激相结合，经训练强化后，单独呈现条件刺激实现对免疫系统的影响。越来越多的研究表明，条件免疫反应和支气管哮喘的发作存在密切联系。本实验建立慢性哮喘小鼠模型，以声音为条件刺激，以布地奈德和沙丁胺醇联合雾化吸入为非条件刺激，建立条件免疫反应，观察条件免疫反应对于慢性哮喘小鼠呼吸频率的影响及肺组织病理学改变。 方法： 1.实验动物及分组： 雌性BALB/c小鼠90只，体重20-24g，6-8周龄。将小鼠随机分为6组（n=15）： A组：条件免疫反应组，以声音为条件刺激，布地奈德和沙丁胺醇联合雾化吸入为非条件刺激，建立条件免疫反应，治疗20周。 B组：常规治疗组，联合雾化吸入布地奈德和沙丁胺醇，1次/日，共20周。 C组：减量治疗组，联合雾化吸入布地奈德和沙丁胺醇，1次/日，共7天，之后1次/周，共20周。 D组：声音刺激组，仅给予声音刺激，1次/日，共20周。 E组：哮喘对照组。 F组：健康对照组。 2.建立慢性哮喘小鼠模型： A组、B组、C组、D组和E组小鼠于第1天和第14天分别腹腔注射0.2mlOVA致敏剂溶液，第21天开始至实验结束予OVA雾化吸入，1次/日，每次30分钟，建立慢性哮喘小鼠模型。健康对照组小鼠，PBS替代OVA致敏和雾化激发。 3.记录各组小鼠呼吸频率的变化。 4.苏木素&伊红染色观察肺组织病理学改变。 5.Masson三色染色法观察肺组织胶原纤维生成情况。 6.统计学分析。 结论： 以声音为条件刺激，以布地奈德和沙丁胺醇联合雾化吸入为非条件刺激，建立条件免疫反应，可以减轻炎症反应，抑制纤维化，对慢性哮喘小鼠具有治疗作用。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:缩略语表

声明

第一部分 炎症区域分子-1参与哮喘小鼠肺血管生成

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

附图

参考文献

第一部分 雾化吸入布地奈德对慢性哮喘小鼠缺氧诱导因子-1α及血管内皮生长因子表达的影响

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

附图

参考文献

第三部分 条件免疫反应对慢性哮喘小鼠的作用研究

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

附图

参考文献

综述1 哮喘肺组织血管生成及其机制研究

综述2 抵抗素样分子与炎症反应

综述3 条件免疫反应的胆碱能通路机制研究

致谢

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