玉米粗缩病7号染色体抗病位点的精细定位

摘要

玉米（Zea mays L．）是世界上重要的粮食兼饲料作物，在国民经济中占有非常重要的地位。玉米粗缩病（MRDD）是一种广泛分布的病毒性病害，近年来在我国蔓延流行，造成了很大的危害，严重影响了玉米产量。充分利用已有的抗性资源，定位和克隆粗缩病抗性基因，深入研究抗病机制是从根本上解决病害问题的有效途径。 本实验室王飞利用掖478×90110的后代将玉米粗缩病的三个抗病位点定位到6、7、8三条染色体上。6号染色体抗病位点被定位到SSR标记umc1656和bnlg2191之间，7号染色体抗病位点被定位到SSR标记umc1401和umc1666之间，8号染色体抗病位点被定位到SSR标记bnlg1823和umc1268之间。在利用（掖478×90110）F2群体构建的分子标记连锁图谱中umc1656和bnlg2191之间的遗传距离为4．5cM，umc1401和umc1666之间的距离为11．1cM，bnlg1823和time1268之间的距离为5．8cM。 根据（掖478×90110）F2群体中玉米粗缩病抗病位点的定位结果，本工作选用了来自抗病自交系90110和感病自交系掖478杂交后代的重组自交系F038141和F072141为亲本，构建它们的F2群体，即为定位群体。F038141和F072141在6号染色体位点均表现为感病基因型，用连锁标记umc1656检测时，电泳条带与掖478一致；在8号染色体位点均表现为抗性基因型，用连锁标记bnlg1823和umc1268检测时，电泳条带与90110一致；两者在7号染色体上的位点存在差异，前者表现为感病基因型，后者表现为抗病基因型。 根据NCBI上提供的玉米基因组测序序列，在umc1401和umc1666之间设计SSR引物47对，筛选可在90110和掖478间以及F2群体中表现出多态性的标记，其中13个SSR标记产生清晰的差异带，用于对定位群体进行SSR作图分析，最终将玉米粗缩病7号染色体上的抗病位点定位到SSR标记umc1401和L6之间的1．4cM的范围内，与umc1401和L6的遗传距离均为0．7cM。为了确定结果的可靠性，同时构建了90110与掖478的F2群体在此区域的局部分子标记连锁图。 用424对RAPD引物对抗病亲本90110，感病亲本掖478，F2抗池，F2感池DNA进行扩增，经过筛选发现在亲本间存在多态性的引物有257个，在亲本间没有多态性的引物有148个，无扩增产物和扩增条带极弱的有19个，多态率为58％。其中引物S217扩增的条带在两个亲本问存在多态性，并且此多态性与抗感、池的扩增结果相一致，差异带在340bp左右。测序结果表明这个片段全长329bp，位于4号染色体上BAC重叠群AC196110．4中，与预测基因FG14的部分序列及其随后的3’端序列匹配。该预测基因全长2151bp，由四个外显子和三个内含子组成，编码蛋白属于半胱氨酸蛋白酶抑制因子家族，编码蛋白全长184aa。 利用生物信息学数据库maizesequence和NCBI的conserved domain程序找到了4个存在于定位区间umc1401和L6之内的可能性比较大的候选基因。其中AC203054．4的FG034含有抗病基因保守结构域核苷酸结合位点，AC206581．2的GRMZM2G131926含有两个抗病基因保守结构域丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶和亮氨酸重复序列，AC196440．3的GRMZM2G094867属于Harpin诱导蛋白家族，AC225799．2的GRMZM2G100012属于细胞色素P450家族蛋白。根据已知的抗病基因的结构特征，这几个基因值得重点研究。 另外，本工作研究了三重SSR引物反应体系，找到了一个适用于同时可进行三个玉米粗缩病抗病位点检测的反应体系，可应用于今后的分子标记辅助选择育种。 本工作对玉米粗缩病7号染色体抗病位点进行了精细定位，筛选出部分候选基因，并研究了三重SSR引物反应体系，为今后的玉米粗缩病抗病基因克隆和分子标记辅助育种打下初步的基础。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：符号说明

声明

第一章前言

1.1玉米粗缩病概述

1.1.1玉米粗缩病危害

1.1.2发病症状和病原鉴定

1.1.3.玉米粗缩病病毒的分布与鉴定

1.1.4玉米粗缩病的传毒媒介及发病规律

1.1.5玉米粗缩病的防治

1.2玉米粗缩病抗性的鉴定及遗传研究

1.2.1玉米粗缩病的分级标准

1.2.2玉米粗缩病的种质资源鉴定

1.2.3人工接种鉴定

1.2.4玉米粗缩病的遗传研究

1.3抗病基因研究进展

1.3.1分子标记技术及应用

1.3.2玉米遗传连锁图谱

1.3.3植物抗病基因研究进展

1.4.玉米抗病基因定位与克隆研究

1.4.1玉米抗病基因定位研究的现状

1.4.2玉米粗缩病抗病基因定位研究

1.4.3玉米抗病基因克隆及策略

1.5本工作的目的和意义

第二章材料和方法

2.1实验材料及抗病性鉴定

2.1.1亲本材料和作图群体

2.1.2植株抗病性鉴定

2.1.3抗性遗传分析

2.2玉米叶片DNA的提取和纯化

2.3 RAPD分析

2.3.1 DNA模板与RAPD引物

2.3.2 RAPD反应体系与反应程序

2.3 3 RAPD引物的筛选

2.3.4 PCR产物的回收、克隆及测序

2.4 F2群体SSR局部遗传连锁图谱的构建

2.4.1新引物的设计与合成

2.4.2 SSR反应体系和反应条件

2.4.3 PCR扩增产物的电泳分析

2.4.4 SSR引物筛选

2.4.5 F2群体单株分析及电泳带谱的数字化

2.4.6构建SSR标记局部遗传连锁图谱

2.4.7 7号染色体位点抗病基因的SSR标记定位

2.5候选基因的生物信息学分析

2.6三引物SSR-PCR反应体系的建立(见附录)

第三章结果与分析

3.1植株抗病性鉴定

3.2 RAPD标记分析

3.2.1筛选RAPD标记

3.2.2定位群体的RAPD分析

3.3 F2群体SSR局部遗传连锁图谱的构建

3.3.1 SSR标记的多态性

3.3.2局部遗传图谱的构建

3.4 7号染色体抗病位点的SSR标记定位

3.5覆盖7号抗病位点的物理图谱的构建

3.6候选基因的生物信息学分析

第四章讨论

4.1玉米粗缩病抗病基因的精细定位

4.2候选基因的功能验证

4.3分子标记辅助育种的前景

附录

参考文献

致谢

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