锰职业接触工人生物标志物的研究

摘要

锰是机体代谢的必需微量元素之一，适量的锰在体内充当某些酶的活性基团、激活因子等，同时参与中枢神经的生理功能。锰及其化合物又是重要的工业原料，应用广泛，常用于电焊作业以增强焊接的硬度和强度。工业中锰过量接触会导致职业性锰中毒的发生，对机体的神经、免疫、生殖等各方面造成损伤。我国锰的消耗量超过千万吨，职业性慢性锰中毒的发生率较高，给国家造成巨大经济损失。目前慢性锰中毒无经济有效的治疗方法，而且国家对其诊断无统一有效的标准，早期外周组织相应的标志物检测亦无相应的有力证据。之前的大多数研究都是检测工作场所周围空气中的平均锰浓度，而忽略了个体锰实际暴露剂量的测定。本课题即是从个体锰实际暴露剂量出发，研究暴露剂量与生物材料中各指标之间的相关性，以寻找合适的生物标志物为锰的接触评价提供依据。 目的： 建立一种能同时测定人尿液中高香草酸和香草扁桃酸含量的高效液相色谱荧光检测方法，并探讨锰接触工人个体实际接触剂量与生物指标之间的关系以寻找合适的早期生物学监测指标。 方法： 本课题选择济南市某机车车辆厂电焊作业工人270名，其中男238人，女32人，均排除各种肝、肾疾病，无其他毒物接触史，无长期药物服用史。收集此270人的血液和尿液进行分析。 对尿液中高香草酸和香草扁桃酸的测定进行方法学摸索和验证。根据文献参考，选择高效液相色谱—荧光检测器的方法测定。尿样经0．45μm滤膜过滤后直接进样，经ODS色谱柱（250 mm×4．6 mm，5．0μm）室温分离，以甲醇—0．1 mol/L pH=5．6的磷酸盐缓冲液（体积比20：80）为流动相，流量1 ml/min，进样量10μl，激发波长277 nm，发射波长320 nm。 火焰原子吸收光谱法测定血锰、尿锰和个体锰暴露剂量；高效液相色谱—荧光法测定尿中高香草酸和香草扁桃酸；从血液中提取DNA进行谷氨酸脱羧酶67（GAD67）和血红素加氧酶—1（HO—1）基因多态性分析，GAD67采用PCR结合限制性内切酶（MnlⅠ）进行片段长度多态性（RFLP）分析；HO—1则通过研究启动子（GT）序列的长度进行多态性分析。对各指标进行相关性研究和方差分析。 结果： 尿中高香草酸和香草扁桃酸的分离测定过程在15 min之内完成，香草扁桃酸、高香草酸保留时间分别为3．18、6．54 min。高香草酸检出限为0．15μg/ml。线性范围0～25μg/ml，加标回收率84．5%～102．1%，相对标准偏差<3．44%。香草扁桃酸检出限为0．13μg/ml，线性范围0—20μg/ml，加标回收率94．7%～101．3%，相对标准偏差<2．16%。 个体锰与血锰、尿锰之间均无相关性，提示血锰、尿锰均不能作为评价锰实际接触剂量的指标，即不能作为评价锰接触的暴露生物标志。 个体锰暴露剂量与尿HVA之间有负相关性（r=—0．168，P<0．01），且有显著统计学意义；与尿中HVA、VMA的均值有负相关性（r=—0．172，P<0．01），且有显著统计学意义。提示尿HVA、尿中二酸均值随着个体锰接触剂量的增加呈下降趋势，二者均可以作为职业性锰中毒诊断的效应生物标志物指标评价锰接触的情况。 DNA经扩增、MnlⅠ酶切后将GAD67分为CC、TC、TT三种基因型，共测定132份样品。按个体锰暴露将其分为高、低两组，分析组内各基因型对应的工人尿HVA、HVA与VMA均值之间的差异。方差分析结果无统计学差异，提示GAD67的MnlⅠ酶切位点不能作为评价锰接触的遗传易感性生物标志。 DNA经扩增、银染后将HO—1的启动子重复序列长度分为S/S，S/M，S/L，M/M，M/L和L/L六种基因型，共测定样品132份。按个体锰暴露将其分为高、低两组，分析组内各基因型对应的工人尿HVA、HVA与VMA均值之间的差异，方差分析结果无统计学差异。按是否含有L等位基因把六种基因型分为两类基因型，比较两组内工人尿HVA、HVA与VMA均值之间的差异，t检验结果显示两组内的两类基因型之间均有统计学差异，提示HO—1基因的L等位基因可以作为评价锰接触的遗传易感性生物标志。 结论： 本实验样品前处理简单，样品稳定，保存时间长；方法灵敏度高、重现性好。完成一次样品分析需要15 min，标准曲线线性良好。方法各项指标均达到《生物材料分析方法的研制准则》的要求，能准确测定尿液中高香草酸和香草扁桃酸的含量，适用于大批样品的测定。 血锰、尿锰均不能作为评价锰接触的暴露生物标志；尿HVA、尿中HVA与VMA的均值都可以作为评价锰接触的效应生物标志，尿VMA则不可以；年龄、性别是锰接触效应发生的重要影响因素。GAD67 MnlⅠ型酶切位点不能作为评价锰接触的遗传易感性生物标志； HO—1基因启动子的L型基因位点可以作为评价个体锰接触的遗传易感生物标志。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：符号说明

声明

前言

材料与研究对象

实验方法

实验结果与讨论

结论

附录

参考文献

致谢

攻读硕士期间发表论文