细菌内毒素脂多糖对人蜕膜基质细胞单核细胞趋化蛋白-1表达影响的研究

摘要

从免疫学角度讲，妊娠相当于成功的半同种异体移植，妊娠建立与维持取决于胚胎植入及发育过程中母体蜕膜局部乃至全身免疫系统的状态。母体与胎儿之间维持着精妙的免疫平衡，一方面耐受胎儿使其得以植入并在宫内正常发育，另一方面适度活化抵抗病原体侵袭，以免感染后蜕膜局部免疫系统发生变化，打破母胎间的免疫平衡，使母体排斥胎儿，进而引起流产、胎儿畸形、胎儿宫内生长受限、子痫前期子痫等病理妊娠的发生。母胎之间的免疫平衡有赖于多种免疫细胞和细胞因子的协调作用，研究发现单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)具有抗感染及介导耐受的双向作用，妊娠早期蜕膜基质细胞高表达MCP-1及其受体CCR2，多种炎性因子可刺激蜕膜基质细胞(DSC)分泌MCP-1，提示其在感染过程中蜕膜局部免疫平衡的维持方面具有重要作用，因此推测感染可影响其在DSC的表达。目前尚无DSC培养的公认方法，为建立一种科学的DSC体外培证明本实验结果的可靠性，本实验同时进行了DSC体外培养的方法学探讨。
　　 目的：
　　 观察体外模拟早孕微环境（雌激素、孕激素）条件下革兰氏阴性细菌内毒素脂多糖(LPS)对人蜕膜基质细胞MCP-1表达的影响，同时探讨蜕膜基质细胞体外培养时传代纯化法对该表达的影响。
　　 方法：
　　 选取正常妊娠妇女人工流产蜕膜组织（6-8周），按常规方法分离蜕膜基质细胞，在含有或不含有雌激素、孕激素培养基中传代培养，普通光镜下分别观察第一代(P1)与第三代细胞(P3)的形态；采用免疫细胞化学法（细胞角蛋白7和波形蛋白）分别鉴定两代细胞的纯度，采用流式细胞技术检测两代细胞表面Toll样受体-4(TLR4)、CCR2分子的表达水平；当细胞铺板率为80％时，将第一代细胞和第三代细胞分别分为空白对照组、LPS（1μg/mL）刺激组。另外，细胞分别在含与不含雌激素+孕激素的培养基中培养传代三次后各分为空白对照组、LPS刺激组。37℃、5％CO2培养24h后收集上清，Trizol裂解后按常规方法提取总RNA，用RT-PCR与实时定量PCR技术检测MCP-1转录水平的表达，ELISA法检测上清中MCP-1的表达。
　　 结果：
　　 1、DSC体外培养的方法学探讨：
　　 ①与传代一次的细胞相比，传代三次的细胞形态变规则，细胞突起减少，胞浆内颗粒明显减少，透明度增加，极性减弱或者消失。
　　 ②免疫细胞化学染色显示，传代三次细胞较传代一次细胞DSC纯度增加(P<0.05)。
　　 ③流式细胞仪检测结果显示，与传代一次细胞相比，传代三次细胞表面TLR4、CCR2分子表达下调(P<0.05)。
　　 2、LPS对DSC MCP-1表达水平的影响：
　　 ①RT-PCR、ELISA显示，，传代一次细胞LPS刺激前即高表达MCP-1，刺激后变化无统计学差异（P0.05）；与传代一次细胞空白对照组相比，传代三次细胞空白对照组MCP-1表达水平显著降低(P<0.05)，但经LPS刺激后，其LPS刺激组较对照组显著上调(P<0.05)；传代三次细胞LPS刺激组MCP-1表达水平与传代一次细胞LPS刺激组无明显差异（P0.05）。
　　 ②RT-PCR、实时定量PCR、ELISA显示，与空白对照组相比，传代三次细胞LPS刺激组、雌激素+孕激素处理组、雌激素+孕激素+LPS处理组在转录水平与分泌水平上MCP-1的表达显著上调(P<0.05)：与雌激素+孕激素处理组和单纯LPS刺激组相比，雌激素+孕激素+LPS处理组MCP-1表达水平显著上调(P<0.05)。
　　 结论：
　　 1、传代可纯化分离培养的DSC，但也使其胞膜表面分子TLR4、CCR2表达水平下降。
　　 2、LPS通过与DSC表面TLR4作用，直接或间接地在转录水平与分泌水平上调DSC的MCP-1表达，影响蜕膜局部免疫状态。
　　 3、雌、孕激素联合作用可上调早孕期DSC MCP-1的表达，提示MCP-1可能对于正常妊娠的发生和维持具有不可忽视的作用。
　　 4、雌、孕激素联合作用还可增强LPS对MCP-1的上调作用，说明MCP-1在妊娠早期蜕膜抗感染方面有重要意义。
　　 创新点：
　　 1、取材新：目前国内外研究妊娠蜕膜微环境的实验室及相关文献报道较少。
　　 2、本实验首次发现LPS可上调蜕膜基质细胞MCP-1表达水平。
　　 3、本实验首次对传代培养DSC的方法进行了较完善的研究，发现传代可下调DSC表面CCR2、TLR4表达水平，但不影响本实验过程中TLR4的活性。

目录

文摘

英文文摘

CONTENTS

英文缩写词表

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

附图

参考文献

致谢

学位论文评阅及答辩情况表