中药对侵袭性真菌感染动物模型的调控及血液肿瘤患者真菌感染的DNA检测

摘要

第一部分：侵袭性真菌感染动物模型的建立及中药对侵袭性真菌感染动物模型的调控目的：深部真菌感染多为条件致病菌感染，在免疫力正常的人群中发病率并不高。近年来，由于大剂量的广谱抗生素、免疫抑制剂和激素的广泛使用甚至滥用，导致患者体内菌群失调和机体免疫力下降，深部真菌感染极易发生。侵袭性真菌感染(IFI)已日益成为导致恶性血液病患者死亡的重要原因之一。目前临床上抗真菌治疗大多依赖西药，其药物毒性大、价格相对昂贵的缺点是显而易见的。而国内不乏优良的抗真菌中药，但由于起步较晚，应用有限，值得更进一步的研究。本实验旨在通过建立侵袭性真菌感染的动物模型，并应用中药对其进行调控，来观察和探讨中药抗真菌的疗效和意义，为抗真菌中药的广泛应用提供理论基础。
　　 方法：选取清洁级雌性SD成年大鼠12只，随机分为四组，分别为A组（免疫抑制+接种孢子+中药治疗组）4只，B组（免疫抑制+接种孢子+蒸馏水组）4只，C组（免疫抑制+未接种孢子组）2只，D组（正常对照组，未免疫抑制+未接种孢子）2只。免疫抑制采用经腹腔注射环磷酰胺的方法，接种孢子采用鼻腔滴入法，孢子为浓缩的烟曲霉菌孢子悬液(浓度为1*107)，中药洽疗采用灌胃法，从而建立真菌感染动物模型。实验动物定期采血及处死，血液样本行血清GM检测（半乳糖甘露聚糖检测），各组动物处死后取肺组织行HE染色及PAM染色（过碘酸六胺银染色）制片镜检以查找真菌孢子或菌丝，部分肺组织行组织培养。
　　 1.GM检测结果：以GM检测i值>0.5为阳性判断结果显示免疫抑制+接种孢子组(A+B组)GM检测阳性率可达81.5％，其中A组检测阳性率为：75％，B组GM检测阳性率为86.7％，A、B两组比较差异无统计学意义(P>0.05)，以GM检测i值>0.7为阳性判断结果显示：A、B两组GM检测阳性率为：44.4％，其中A组检测阳性率为：8.33％，B组GM检测阳性率为73.3％，A组与B组阳性率比较差异显著，有统计学意义(P<0.01)。C组均为阴性，D组除一个样本阳性外余皆为阴性，考虑为污染造成的假阳性。A组GM检测值明显低于B组，因样本量较小，结果的统计学意义不明显。
　　 2.动物模型肺组织病理学检查：免疫抑制+接种孢子组（A+B组）：共8只大鼠，均可见不同程度的肺组织实变及炎性细胞浸润，其中2只大鼠于接种后第7天行肺组织镜检在组织中发现曲霉菌菌丝，C组仅为免疫抑制组，肺组织切片染色后镜检可见肺组织炎性病理改变。D组为正常对照组，肺组织切片染色后镜检未发现明显异常改变。
　　 3.肺组织培养：各组动物肺组织匀浆培养7天均未发现曲霉菌生长。
　　 结论：1.该中药方剂对大鼠真菌感染有一定治疗作用。2.GM检测可先于组织出现病灶之前发现真菌感染，可用于侵袭性真菌感染的早期诊断。
　　 第二部分：血液肿瘤患者真菌感染的DNA检测目的：
　　 1.用实时荧光PCR方法检测血液科发热病人血清中的曲霉菌DNA含量，并与GM试验和临床表现相对比，探索其一致性和准确性。
　　 2.评价实时荧光PCR法对侵袭性真菌感染的早期诊断价值。
　　 方法：选取2008-2010年在山东省立医院血液科住院的发热病人的血清，行GM检测，检测阳性者利用Qiamp DNA MiNi Kit试剂盒提取病人血清样本中的曲霉菌DNA，选取曲霉菌特异性引物，优化实验方法，设立阴性对照及标准品，绘制标准曲线，建立SYBR Green法Real-Time PCR的实验室方法来定量检测临床发热病人的曲霉菌感染，并与GM检测方法作对比，探索其一致性和准确性。
　　 结果：利用Qiamp DNA MiNi Kit试剂盒所提取的曲霉菌DNA浓度和纯度经仪器测试后基本符合Real-Time PCR的实验要求，建立的实时荧光PCR方法扩增曲线及熔解曲线形态不甚满意，有大量非特异性扩增，标准曲线相关系数R2为0.97(＜0.99)，未能形成有效的标准曲线。PCR产物行琼脂糖凝胶电泳，样品均无特异性扩增条带，所设标准品PCR产物的琼脂糖凝胶电泳出现非特异性扩增条带，扩增产物大小>500Bp，所有样品均出现引物二聚体的扩增条带，大小为lOObp左右，均不是我们想得到的168bp的特异性条带。
　　 结论：本次试验结果不甚满意，认真回顾实验过程并分析实验原理后认为：本次实验的设计思路及原理是科学合理的，但由于实验过程中的人为因素（包括加样不准确、技术不熟练等因素），及所选用用试剂及引物的非正常工作性，实验未能取得预期的结果，因时间仓促，无法继续进行试验，本次试验的目的亦未能完全达到。

目录

文摘

英文文摘

CONTENTS

符号说明

第一部分 侵袭性真菌感染动物模型的建立及中药对侵袭性真菌感染动物模型的调控

前言

材料和方法

结果

讨论

参考文献

第二部分 血液肿瘤患者真菌感染的DNA检测

前言

材料和方法

结果

讨论

参考文献

综述 恶性血液病患合并侵袭性真菌感染临床用药的现状

致谢

攻读学位期间发表的论文

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