乙肝病毒核心蛋白参与肝癌发生的生物学作用与机制探讨

摘要

目的： 1.探讨HBc蛋白在肝癌发生发展中的作用，进一步解读其生物学功能。2.筛选出在HBc参与肝癌发生中发挥作用的关键分子，以期进一步阐明HBV相关HCC发生的分子机制，获得新的肝癌生物治疗靶点和肿瘤诊断标志物。
　　 方法：
　　 一、乙肝病毒核心蛋白(HBc)真核表达载体的构建与表达。
　　 1.构建HBc融合表达载体pcDNA3.0-HBc-HA和pEGFP-HBc根据PubMed中HBc序列，利用PrimerPremier5.0软件，设计扩增带有HindⅢ和EcoRV或HindⅢ和BamHⅠ不同酶切位点的特异性引物，并在构建pcDNA3.0-HBc-HA载体的下游引物引入HA-tag序列。以pUC19/3.0HBV为模板，分别以二对引物扩增HBc。PCR产物经双酶切、回收后分别克隆入pcDNA3.0及pEGFP-N1载体。连接产物转化大肠杆菌JM109，LA平板筛选挑取阳性重组子，并经酶切、PCR、DNA测序分析鉴定，分别命名为pcDNA3.0-HBc-HA和pEGFP-HBc。
　　 2.HBc真核表达质粒在肝癌细胞中的表达
　　 常规转染含有HBc的真核表达质粒及其对照质粒，分别收集处于对数生长期的BEL7402-pcDNA3.0、BEL7402-pcDNA3.0-HBc-HA、BEL7402-pEGFP-N1、BEL7402-pEGFP-HBc细胞。首先用Trizol方法提取细胞总RNA，在mRNA水平检测HBc基因的表达。然后常规收集BEL7402-pcDNA3.0和BEL7402-pcDNA3.0-HBc-HA细胞蛋白，Western blot方法检测其蛋白水平的表达；同时将pEGFP-HBc转染组及pEGFP转染组细胞培养板置于荧光显微镜下，观测绿色荧光蛋白的表达情况，拍照记录结果。
　　 3.pEGFP-HBc重组质粒稳定转染肝癌细胞系的建立及其鉴定
　　 将pEGFP-N1或pEGFP-HBc质粒分别转染BEL7402细胞，转染后24h，将细胞传代至6孔板中，并加入选择性药物新霉素G418，挑选阳性克隆。未转染细胞在G418的作用下逐渐死亡，而转染细胞具有G418抗性，形成细胞克隆。阳性克隆经稳定传代培养，建立可稳定表达HBc基因的肝癌细胞系，并在mRNA及蛋白水平验证HBc的表达。
　　 二、乙肝病毒核心蛋白对肝癌细胞系生物学功能的影响。
　　 1.正反向论证HBc蛋白对肝癌细胞生长的影响
　　 取生长状态良好的HepG2和BEL7402细胞，分别以1×104个/孔接种于96孔板中，次日分别将重组质粒pEGFP-HBc及对照质粒pEGFP-N1转染HepG2和BEL7402细胞，转染之后每隔24h，用CCK-8检测细胞生长情况，连续检测5天，绘制生长曲线，观察HBc对细胞生长的影响。相同方法检测BEL7402-pEGFP-HBc和BEL7402-pEGFP-N1稳筛细胞系的生长情况，以及小干扰RNA封闭HBc前后HepG2.2.15细胞的生长情况。
　　 2.正反向论证HBc蛋白对肝癌细胞集落形成能力的影响
　　 取生长状态良好的HepG2和BEL7402细胞，以3×105个/孔接种于24孔板中，次日分别将重组质粒pEGFP-HBc及pEGFP-N1对照质粒转染HepG2和BEL7402细胞，转染之后24h，将细胞经胰酶消化后，以适当的细胞密度接种于六孔板中，静置培养2-3周，之后用龙胆紫染色，肉眼计数细胞克隆数，计算克隆形成率。相同方法检测BEL7402-pEGFP-HBc和BEL7402-pEGFP-N1稳筛细胞系的集落形成能力，以及小干扰RNA封闭HBc前后HepG2.2.15细胞的集落形成能力。
　　 3.HBc对BEL7402细胞系细胞周期的影响。
　　 BEL7402细胞常规转染pEGFP-HBc及pEGFP-N1质粒24h后，胰酶消化制备单细胞悬液，80％乙醇固定，PI染色30min后上样流式细胞仪检测细胞周期。相同方法检测BEL7402-pEGFP-HBc和BEL7402-pEGFP-N1稳筛细胞系间细胞周期的差异。
　　 4.HBc对血清饥饿诱导细胞凋亡的影响
　　 取对数生长期的稳定转染的BEL7402-pEGFP-HBc和BEL7402-pEGFP-N1细胞，接种于24孔板内。20h后，更换成含0.1％FCS的低血清培养基，继续培养72h后，消化、收集细胞（包括上清中漂浮的细胞），PBS洗涤，TUNEL染色，流式细胞仪检测、分析细胞的凋亡率。
　　 5.HBc对肝癌细胞的运动力及侵袭力的影响。
　　 取对数生长期的稳定转染的BEL7402-pEGFP-HBc和BEL7402-pEGFP-N1细胞悬液，分别接种于铺或未铺matrigel的24孔板中，培养24h(检测运动力时为8h)将各小室取出，用湿棉棒轻轻擦去上室中细胞，固定，待小室膜风干后置入到有结晶紫染液的孔中，染色20min，取出小室，用流水冲干净显微镜下计数10个高倍镜视野，计算整个小室膜上穿膜细胞数。
　　 三.HBc参与肝癌发生中的分子机制研究。
　　 1.HBc蛋白对肝癌细胞中抑癌基因DLC-1的表达调控作用。BEL7402细胞中过表达HBc，Realtime-PCR的方法检测DLC-1表达的变化，同时反义封闭HepG2.2.15细胞中HBc基因的表达，RT-PCR检测DLC-1表达变化，并用实时荧光定量PCR检测HBV转基因小鼠和正常BALB/c小鼠肝组织中DLC-1基因的表达差异。
　　 2.乙肝病毒核心蛋白反式激活端粒酶逆转录酶表达和活性的研究。以pUC19/3.0HBV为模板，分别以二对引物PCR扩增不同的HBc基因片段。PCR产物分别经HindⅢ和EcoRV或HindⅢ和BamHⅠ双酶切，回收后分别克隆入经相同双酶切的pcDNA3.0及pEGFP-N1载体，构建真核融合表达质粒，命名为pcDNA3.0-HBc-HA和pEGFP-HBc。两种重组质粒分别以HindⅢ、BamHⅠ做单酶切，HindⅢ和EcoRV及HindⅢ和BamHⅠ双酶切，分别获得与预期大小一致的目的片段；进一步用PCR及DNA测序证明pcDNA3.0-HBc-HA和pEGFP-HBc重组载体构建成功。RT-PCR检测转染BEL7402细胞中HBc mRNA的表达，可见空载体pcDNA3.0和pEGFP-N1转染组细胞中未检测到HBc mRNA的表达，而pcDNA3.0-HBc-HA和pEGFP-HBc转染组细胞均可检测到高水平HBc mRNA的表达。Western Blot检测HBc-HA融合蛋白的表达情况，pcDNA3.0转染组细胞未检测到阳性条带，而pcDNA3.0-HBc-HA转染组则可见较强的HBc-HA融合蛋白的表达。另取转染48h后的pEGFP-HBc转染组及pEGFP-N1转染组细胞，置于荧光显微镜下，两组细胞均可观察到较强的绿色荧光蛋白的表达。BEL7402细胞经稳定或瞬时转染pEGFP-HBc质粒后，细胞的生长能力显著高于空载体转染组细胞，且在HepG2细胞中得到相似的结果，表明HBc蛋白的表达可增强肝癌细胞的生长能力。血清饥饿法处理BEL7402-pEGFP-HBc和BEL7402-pEGFP-N1细胞，TUNEL流式细胞术检测细胞凋亡。结果显示，BEL7402-pEGFP-HBc细胞凋亡率显著低于对照组细胞，该结果与前期研究发现的HBc蛋白可下调细胞对TRAIL诱导凋亡敏感性的结果相一致，表明HBc可使细胞抵抗不同刺激诱导的凋亡。将HBc表达质粒或其对照质粒转染肝癌细胞BEL7402，48h后，收集细胞总RNA，RT-PCR检测抑癌基因DLC-1的表达。结果显示，与对照组相比，HBc的表达可显著下调BEL7402细胞中DLC-1mRNA水平。利用反义寡核苷酸特异性封闭HepG2.2.15细胞中HBc基因的表达，48h后收集细胞总RNA，RT-PCR结果显示DLC-1在mRNA水平表达有明显升高。另外提取HBV转基因小鼠及正常对照小鼠的肝组织RNA，实时定量PCR结果显示HBV转基因小鼠肝组织中DLC-1表达水平明显低于对照组小鼠。 肝癌细胞BEL7402中梯度转染HBc表达质粒，48h后，收集细胞总RNA，RT-PCR检测显示，随着HBc表达水平的增加BEL7402细胞中hTERT mRNA水平亦呈现增高趋势。HepG2.2.15细胞中转染入针对HBc的小干扰RNA载体，48h后收集细胞总RNA，RT-PCR结果显示HBc表达水平的下调hTERT mRNA水平呈现下降趋势。另外，PCR-TRAP方法检测BEL7402-pEGFP-HBc和BEL7402-pEGFP-N1细胞中端粒酶活性，结果显示，BEL7402-pEGFP-HBc细胞端粒酶活性显著高于对照组细胞。
　　 结论：
　　 1.本研究成功构建了两个可在肝癌细胞中有效表达HBc融合蛋白的真核表达载体pcDNA3.0-HBc-HA和pEGFP-HBc，为进一步研究HBc的功能提供了必要的条件。
　　 2.首次对HBc蛋白在肝癌发生中的生物学作用进行研究，并证明HBc可增强肝癌细胞的生长增殖能力，为进一步深入研究HBc的功能提供了新的方向，同时也为发现肝癌治疗新靶点提供实验理论依据。
　　 3.首次深入探讨HBc蛋白参与肝癌发生的分子机制，并筛选出可能在HBc致肝癌中发挥重要作用的两个分子DLC-1和hTERT，为进一步阐明了HBV相关肝癌的发病机制提供了新的切入点。

目录

文摘

英文文摘

符号说明

第一部分 乙肝病毒核心蛋白参与肝癌发生的生物学作用与机制探讨

前言

技术路线

第一章 乙肝病毒核心蛋白HBc真核表达载体的构建与表达

1 材料

2 方法

3 结果

第二章 乙肝病毒核心蛋白对肝癌细胞系生物学功能的影响

1 材料

2 方法

3 结果

第三章 HBc在肝癌发生中的分子机制研究

1 材料

2 方法

3 结果

讨论

参考文献

第二部分 SLE患者外周血单个核细胞Tim-4基因的表达

前言

技术路线

1 材料与方法

2 结果

讨论

参考文献

附图

致谢

研究生期间发表的论文

学位论文评阅及答辩情况表