S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶基因表达与乳腺癌关系研究

摘要

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，发病率占全身各种恶性肿瘤的7％-10％，其发生机理尚不甚清楚。目前，乳腺癌治疗仍以手术为主，术后辅以局部或全身的放射治疗、化疗及内分泌治疗。近年来随着早期乳腺癌发现率的提高，各种治疗乳腺癌的新方法发展迅速，乳腺癌的治愈率有所提高，但术后复发及远处转移的问题仍是乳腺癌治疗的一大难题。因此寻找一种新型非手术干预的治疗方法对于乳腺癌的预防和治疗具有非常重要的意义。
　　 腐胺、精脒和精胺统称为多胺(polyamine)。多胺可以刺激DNA、RNA的生物合成，是调节细胞生长的重要物质。多胺生物合成途径中有两个关键酶，其中鸟氨酸脱羧酶(ornithine decarboxylase,ODC)是第一个关键酶，能催化鸟氨酸脱羧生成腐胺。S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶(S-adenosylmethionine decarboxylase，SAMDC)则是多胺生物合成的第二个限速酶，能催化甲硫氨酸脱羧，为腐胺转化成精脒和精胺提供丙氨基基团。文献报道SAMDC较ODC是更为有效的细胞转化的诱导因子。关于ODC基因表达与肿瘤发生发展及治疗关系的研究国内外报道较多，关于SAMDC活性与肿瘤关系的研究国外已见报道，但有关SAMDC基因表达与乳腺癌关系的研究尚未见报道。
　　 RNA干扰(RNA interference，RNAi)是目前最有效的基因沉默技术，它是通过双链RNA的介导特异性地降解相应序列的mRNA,从而特异性沉默特定基因的表达。我们构建了shRNA真核表达载体，该载体可以在被转染细胞中启动RNAi，有效抑制SAMDC基因表达。
　　 据此，本研究先从组织水平研究了SAMDC基因表达与乳腺癌的关系，继而利用RNA干扰真核表达载体转染乳腺癌细胞株MCF-7与MDA-MB-231，从细胞水平观察SAMDC基因下调抑制乳腺癌的作用，为研究SAMDC基因作为乳腺癌诊治靶标的可行性奠定基础。
　　 第一部分 SAMDC基因在乳腺癌组织表达水平的研究
　　 【研究目的】
　　 采用免疫组化及RT-PCR技术检测SAMDC基因在乳腺癌组织中的表达。
　　 【研究方法】
　　 (1)标本收集：经10％甲醛处理、常规石蜡包埋的乳腺癌以及正常乳腺组织切片66例，由山东省中医药大学附属医院病理科提供，其中乳腺癌组织46例，正常组织20例。
　　 (2)免疫组化检测乳腺癌组织中SAMDC蛋白含量：所有标本均经10％甲醛处理、常规石蜡包埋切片，免疫组化按博士德公司免疫组化试剂盒说明书操作。多抗稀释浓度为1：500。免疫组织化学染色结果判定在100倍镜下进行。无黄色记为（-），淡棕黄色记为(+)，棕黄色记为(++)，深棕黄色记为(+++)。
　　 (3)收集乳腺癌及其癌旁组织各20例，采用Trizol一步法抽提组织总RNA，RT-PCR检测乳腺癌及癌旁组织中SAMDC mRNA的水平。
　　 【结果】
　　 (1)免疫组化结果显示SAMDC主要存在于细胞浆中，正常组织细胞内染色较浅，多数肿瘤组织细胞内染色较深。乳腺癌组织中的SAMDC表达明显高于正常组织(P<0.01)；不同病例类型的肿瘤细胞内表达未见明显差异(P>0.05)。
　　 (2)RT-PCR结果显示乳腺癌组织中SAMDC mRNA表达量为0.855圭0.10，癌旁组织为0.389±0.04，二者具有显著差异(P<0.01)。
　　 【结论】
　　 本文研究结果证明乳腺癌组织中SAMDC基因表达水平显著增高，提示SAMDC基因表达可作为乳腺癌基因诊断的标志物。
　　 第二部分 SAMDC shRNA真核表达载体对乳腺癌细胞生长抑制作用的体外研究
　　 【研究目的】
　　 观察SAMDC shRNA干扰载体(pGPU6-SAMDC-shRNA)抑制SAMDC基因表达后，对乳腺癌MCF-7及MDA-MB-231细胞增殖及侵袭能力的抑制作用。
　　 【研究方法】
　　 (1)参考文献报道设计SAMDC基因的siRNA片段，表达载体pGPU6-SAMDC-shRNA的合成与构建由上海吉玛公司完成。
　　 (2)利用脂质体转染法将pGPU6-SAMDC-shRNA及其相应空载体分别转染乳腺癌细胞MCF-7及MDA-MB-231，采用荧光显微镜检测转染细胞中GFP表达，以测定乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231细胞的基因转染效率。
　　 (3)RT-PCR和Western-blot技术分别检测乳腺癌细胞中SAMDC mRNA和蛋白质的表达水平。
　　 (4)采用CCK-8细胞增殖活性检测方法检测pGPU6-SAMDC-shRNA及其对照载体对各株细胞增殖活性的影响。
　　 (5)采用流式细胞术检测pGPU6-SAMDC-shRNA及其对照载体对各细胞周期分布的影响。
　　 (6)采用Matrigel侵袭实验分析pGPU6-SAMDC-shRNA对肿瘤细胞侵袭活性的影响。
　　 【结果】
　　 (1)基因转染效率实验结果显示，转染24h后GFP表达阳性细胞超过30％，48h后GFP表达阳性细胞约为50％，72h后GFP表达阳性细胞接近80％。
　　 (2)RT-PCR结果显示SAMDC shRNA表达载体能明显下调SAMDCmRNA的表达，MCF-7和MDA-MB-231细胞SAMDCmRNA水平分别下调43.8％和30％。
　　 (3)Western-blot分析结果显示，pGPU6-SAMDC-shRNA转染细胞中SAMDC蛋白表达量明显降低，MCF-7和MDA-MB-231细胞蛋白表达水平分别下调66.5％和64.9％。
　　 (4)pGPU6-SAMDC-shRNA转染MCF-7和MDA-MB-231细胞可明显抑制其增殖活性，最大抑制率分别为37％和36％。
　　 (5)流式细胞术检测结果显示，pGPU6-SAMDC-shRNA可引起乳腺癌细胞周期阻滞于G0-G1期。
　　 (6)Matrigel侵袭实验显示，pGPU6-SAMDC-shRNA可显著抑制乳腺癌细胞的侵袭能力。
　　 【结论】
　　 shRNA干扰载体pGPU6-SAMDC-shRNA能有效抑制乳腺癌细胞中SAMDC基因的表达，使细胞周期阻滞于G0-G1期，抑制细胞的增殖活性，并明显抑制肿瘤细胞的侵袭能力。进一步证明SAMDC的基因表达与乳腺癌的发生与发展有密切关系，提示SAMDC基因作为乳腺癌基因治疗的靶标具有较大可行性。
　　 上述两部分研究结果显示，乳腺癌组织中SAMDC蛋白及mRNA含量均显著高于正常组织，而体外抑制肿瘤细胞中SAMDC的表达又可有效地抑制肿瘤细胞的增殖活性，表明SAMDC在乳腺癌的发生中起重要作用，提示SAMDC基因表达可作为乳腺癌诊治的靶标，为乳腺癌基因诊治的进一步研究提供了理论依据。

目录

文摘

英文文摘

CONTENTS

符号说明

前言

第一部分： SAMDC基因在乳腺癌组织表达水平的研究

材料与方法

结果

第一部分总结

第二部分： SAMDC shRNA真核表达载体对乳腺癌细胞生长抑制作用的体外研究

材料与方法

结果

第二部分总结

全文讨论

全文总结

参考文献

致谢

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