高浓度顺铂溶液在脊柱恶性肿瘤切除术中局部应用可行性的实验研究

摘要

本研究分为二部分：
　　 第一部分：短时间应用高浓度顺铂溶液对恶性骨肿瘤细胞杀伤作用的实验研究
　　 研究背景：目前，手术治疗仍旧是脊柱恶性肿瘤治疗的主要方法之一，但由于脊柱周围的脊髓、神经、血管等解剖结构复杂而重要，使脊柱肿瘤的手术治疗难以像四肢骨肿瘤一样达到广泛或根治性切除。长期以来刮除或囊内切除术仍是临床普遍应用的手术方法。随着脊柱肿瘤分期系统的发展和脊柱肿瘤手术技术的完善以及治疗理念的更新，学者们提出了脊柱肿瘤全脊椎整块切除术的概念。全脊椎整块切除的基本原理是沿着正常组织切除(边缘切除或广泛切除)肿瘤，从而减少局部复发率，提高病人的长期生存率。但即使全脊椎切除，出于保护脊髓的目的，在脊髓周围切除肿瘤时会异常小心，有时不可避免的进行肿瘤囊内操作。特别对于侵犯范围较大的肿瘤，仍有肿瘤扩散的风险。这些潜在的风险都会导致手术区域肿瘤细胞的污染，从而增加复发的机会。这样我们在行全脊椎切除术时，除了提高手术技术尽量避免肿瘤囊内操作，也应该探讨一种方法，术中局部短时间应用即可杀灭手术野中可能污染的恶性肿瘤细胞，以减少术后复发。
　　 目的：探讨短时间应用高浓度顺铂溶液对恶性骨肿瘤细胞的杀伤作用，并寻找合适的药物浓度。
　　 方法：将培养的人骨肉瘤细胞U2-OS给予蒸馏水、不同浓度蒸馏水顺铂溶液和生理盐水顺铂溶液(浓度分别为500μg/ml、250μg/ml、125μg/ml、62.5μg/ml、31.25μg/ml)作用5分钟。分别于0h、24h、48h、72h、96h，用MTT法测定吸光光度值(A)，用空白对照组调零，计算各组应用不同药物后的肿瘤细胞抑制率，并进行统计学分析，比较各组用药后肿瘤细胞抑制率之间的差异，用倒置显微镜观察各组用药后在0h、24h、48h、72h、96h的细胞数量和形态变化。将培养的人肺腺癌细胞株A-549和人乳腺癌细胞株MCF-7给予蒸馏水和不同浓度的蒸馏水顺铂溶液(浓度分别为500μg/ml、250μg/ml、125μg/ml、62.5μg/ml、31.25μg/ml)作用5分钟。分别于0h、24h、48h、72h、96h，MTT法测定吸光光度值(A)，用空白对照组调零，计算各组用药后肿瘤细胞抑制率，并进行统计学分析，比较各组用药后肿瘤细胞抑制率之间的差异。
　　 结果：在0h，不同浓度蒸馏水顺铂溶液(浓度分别为500μg/ml、250μg/ml、125μg/ml、62.5μg/ml、31.25μg/ml)和蒸馏水对人骨肉瘤细胞株U2-OS抑制率无显著性差异(P>0.05)。在72h和96h，500μg/ml蒸馏水顺铂溶液、250μg/ml蒸馏水顺铂溶液、125μg/ml蒸馏水顺铂溶液、62.5μg/ml蒸馏水顺铂溶液对人骨肉瘤细胞株U2-OS抑制率无显著性差异(P>0.05)，并均高于为31.25μg/ml蒸馏水顺铂溶液和蒸馏水，且有显著性差异(P<0.05)，肿瘤细胞抑制率均在95％以上。倒置显微镜观察，在72h和96h时，浓度为500μg/ml、250μg/ml、125μg/ml、62.5μg/ml的蒸馏水顺铂溶液作用经换液冲洗后，几乎没有肿瘤细胞存活生长，而蒸馏水作用后仍有较多肿瘤细胞存活生长。不同浓度的生理盐水顺铂溶液对人骨肉瘤细胞株U2-OS的抑制率显著低于蒸馏水顺铂溶液。在0h、24h、48h、72h和96h，随着时间的延长，不同浓度蒸馏水顺铂溶液(浓度分别为500μg/ml、250μg/ml、125μg/ml、62.5μg/ml、31.2μg/ml)蒸馏水对人肺腺癌细胞株A-549和人乳腺癌细胞株MCF-7抑制率逐渐增加。在96h，500μ/ml蒸馏水顺铂溶液、250μg/ml蒸馏水顺铂溶液、125μg/ml蒸馏水顺铂溶液、62.5μg/ml蒸馏水顺铂溶液对人肺腺癌细胞株A-549和人乳腺癌细胞株MCF-7抑制率显著高于31.25μg/ml蒸馏水顺铂溶液和蒸馏水，肿瘤细胞抑制率均在95％以上。
　　 结论：短时间应用500μg/ml、250μg/ml、125μg/ml、62.5μg/ml的蒸馏水顺铂溶液对骨肉瘤细胞、肺腺癌细胞和乳腺癌细胞有强大的杀伤作用，肿瘤细胞抑制率在95％以上。在临床上可以选择浓度为62.5μg/ml-125μg/ml蒸馏水顺铂溶液短时间浸泡手术野，既可以尽量减少顺铂的毒副作用，并配制足够体积的溶液进行冲洗，又能起到杀死手术野中的肿瘤细胞，减少复发的作用。
　　 第二部分：大鼠脊髓周围局部应用高浓度蒸馏水顺铂溶液的安全性研究
　　 研究背景：全身应用顺铂容易引起肾脏、骨髓、肝脏、性腺、甲状腺等多个器官的损伤。近年来，越来越多的学者开始关注顺铂对脊髓的损伤。据文献报道，大剂量的顺铂化疗可以引起中枢神经包括脊髓的脱髓鞘改变。顺铂的神经毒性容易累及背根神经节，产生感觉障碍。有学者研究了铂类化疗药物鞘内注射对大鼠脊髓的神经毒性和超微结构改变，发现大剂量顺铂可引起脊髓的组织学损伤和超微结构改变，但较小剂量不会引起神经毒性反应。在本实验中，由于不是全身用药，而只是短时间局部用药，顺铂的毒副作用可能很低。但是由于脊柱肿瘤周围有脊髓的存在，在其周围应用任何药物都要考虑药物可能对脊髓危害，而且脊柱肿瘤可能对硬膜产生侵袭，术中硬膜囊的破裂有时不可避免，这样可能直接将脊髓暴露于药物。在此情况下顺铂是否会对脊髓产生明显损伤，目前这方面的研究较少。
　　 目的：探讨大鼠脊髓周围应用高浓度蒸馏水顺铂溶液对大鼠脊髓形态和功能的影响。
　　 方法：将Wistar大鼠40只随机分为2大组，每大组20只，分别是蒸馏水顺铂实验组(DW)、生理盐水对照组(NS)。每组分为2小组，各10只，分别是硬膜囊完整组(A)和硬膜囊部分切除组(B)。麻醉大鼠，切除第7、8、9胸椎的椎板，暴露硬膜囊。硬膜囊部分切除组，需要仔细切除部分硬膜和蛛网膜，造成脑脊液漏。在椎板切除大鼠模型的手术区域，按组于硬膜的背侧分别注入浓度500μg/ml的蒸馏水顺铂溶液或生理盐水溶液2ml.，浸泡10分钟后，保留药物缝合切口。硬膜囊部分切除组需仔细缝合以避免脑脊液漏。各组大鼠分别于术前、打开椎板后、硬膜切开后、注入药物后、和术后3周进行体感诱发电位(SEP)检测，并记录波形中SEP的潜伏期及峰间波幅。各组大鼠用改良Tarlov评分于术前，术后1、3、7、14、21天评价后肢的运动机能。将各组大鼠3周后处死取脊髓，观察脊髓在光镜和电镜下的形态学改变。对大鼠脊髓进行免疫组化染色，观察脊髓损伤相关的基因caspase-3和bax的表达。对所有实验结果进行统计学分析，比较各组之间的差异。
　　 结果：各组大鼠麻醉成功后分别于术前、打开椎板后、硬膜切开后、注入药物后、和术后3周进行SEP检测，均获得了理想的波形。局部应用高浓度蒸馏水顺铂溶液，与应用生理盐水对照，在注入药物后和术后3周，对脊髓体感诱发电位潜伏期和波幅的影响无显著性差异(P>0.05)，而且在硬膜囊完整和部分切除的情况下，局部应用高浓度顺铂溶液后脊髓体感诱发电位潜伏期和波幅也无显著性差异(P>0.05)。在术后1、3、7、14、21天，局部应用高浓度蒸馏水顺铂溶液，与应用生理盐水对照，对大鼠下肢运动机能的改良Tarlov评分的影响无显著性差异，而且在硬膜囊完整和部分切除的情况下，局部应用高浓度顺铂溶液后在不同的时间点对大鼠下肢运动机能的改良Tarlov评分的影响也无显著性差异(P>0.05)。光镜下观察各组大鼠脊髓，灰质内神经元的细胞形态完整，细胞核清晰完整，白质内神经纤维排列规则，结缔组织排列较紧密，无明显脱髓鞘改变。电镜下观察各组大鼠脊髓神经元细胞膜完整，细胞核染色质清晰，分布均匀，无凝集现象。髓鞘为同心圆板层排列，密实有序，没有分层和崩解。各组之间无明显差异。免疫组化检测各组大鼠脊髓的caspase-3和bax的基因均有表达，但阳性细胞数无显著性差异。
　　 结论：大鼠脊髓周围应用高浓度蒸馏水顺铂溶液对大鼠SEP潜伏期及峰间波幅、改良Tarlov评分无明显影响；大鼠脊髓光镜和电镜下的形态学改变无明显差异，并且caspase-3和bax的基因表达无明显上调。所以大鼠脊髓周围短时间应用高浓度的蒸馏水顺铂溶液是比较安全的。

目录

文摘

英文文摘

CONTENTS

符号说明

前言

第一部分：短时间应用高浓度顺铂溶液对恶性骨肿瘤细胞杀伤作用的实验研究

材料与方法

结果

讨论

结论

附图

参考文献

第二部分：大鼠脊髓周围局部应用高浓度蒸馏水顺铂溶液的安全性研究

材料与方法

结果

讨论

结论

附图

参考文献

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