BMP-6和VEGF表达载体的构建及其促进成骨作用的实验研究

摘要

在美国，每年骨折的发生大约有600万次，治疗花费大约200亿美元。不能自然愈合的骨折称为骨折不愈合，需要用不同的方法进行手术治疗。由于创伤、骨肿瘤切除及其他病理性因素等引起大块骨缺损和骨不愈合目前仍然是一个重大的临床难题。骨组织工程的发展为提高骨组织再生修复提供了新的治疗思路，组织工程骨移植替代物已被证实是较理想的植骨来源及今后的主要发展方向。尽管已经有很多组织工程骨移植替代物，但治疗效果仍然不是很让人满意。最近的干细胞生物学、基因治疗和骨诱导基质的研究进展促进了携带干细胞和生长因子的骨移植替代物的发展。通过能有效安全的释放促进骨再生修复的生长因子的新的移植材料的发展，可望提高对骨折不愈合、骨质疏松、骨质溶解、骨坏死和一系列骨异常的治疗效果。骨形态发生蛋白(BMP)通过影响骨形成的细胞内信号传导途径在骨再生中发挥中心作用，这些信号传导途径对于通过软骨内骨化过程中调节形成新骨的骨祖细胞分化为软骨细胞和成骨细胞起重要作用。BMP有数种，其中主要是BMP-2和BMP-7，已经被证实能诱导体内成骨，并且已经应用于临床。在具有骨诱导性的BMP中，以前的研究证实BMP-2，-6和-9是骨诱导性最强的BMP，BMP-7稍弱。这些发现提示除了已经用于临床的BMP-2和-7，BMP-6和-9至少具有与BMP-2和-7类似的作用。
　　 血管生成对于组织再生修复是最基本的过程和需要，血管内皮生长因子(VEGF)是已知的最主要的促血管生长因子。有研究表明，VEGF与BMP-2或BMP-4有协同作用，但是在干细胞介导的成骨作用方面，VEGF与BMP-4联合的效果比与BMP-2的效果更强，这提示VEGF与不同的BMP的相互作用的结果是不同的。因为有些BMP的成骨作用更强，因此这也可能促进研究骨修复的骨移植物发展新的策略。迄今为止，VEGF和BMP-6联合在骨修复中的作用还未见报道。本研究选用BMP-6而不选BMP-9是因为有报道指出，BMP-9能抑制VEGF诱导的血管生成作用。聚乳酸羟基乙酸(PLAGA)微球通过热聚合作用聚集成具有三维空间结构的PLAGA支架已经被我们和其他的实验室广泛使用。这种支架具有可预测的、完全整合的孔状网络，因此为细胞的浸润和随后的细胞与细胞、细胞与基质的相互作用提供了必要的三维微环境。
　　 据此，为了研究BMP-6、VEGF及BMP-6和VEGF联合在成骨中的作用，本课题构建了表达质粒pCMV-hBMP-6(pB6)和pCMV-hVEGF(pV)并通过内部核糖体进入位点(IRES)连接编码BMP-6和VEGF的基因构建了表达质粒pCMV-hBMP-6-IRES-hVEGF(pVB6)，三者分别能表达出BMP-6、VEGF和BMP6+VEGF。然后我们利用这些重组质粒系统观察了BMP-6、VEGF以及BMP-6和VEGF联合对克隆的小鼠前成骨细胞系D1细胞在体外促进成骨分化方面的诱导作用。并将所构建的重组质粒pB6，pV和pVB6转染D1细胞后种植到PLAGA支架材料上，构建组织工程骨，体内观察BMP-6、VEGF对D1细胞介导的成骨作用的诱导作用，并观察BMP-6和VEGF在体内促进骨形成方面的协同作用，为大块骨缺损的治疗研究奠定了基础。现将本项研究的主要内容简要介绍如下。
　　 第一部分真核表达载体pB6，pV和pVB6的构建研究目的：
　　 为了研究BMP-6和VEGF在成骨中的作用，构建能表达BMP-6、VEGF和BMP-6+VEGF的重组质粒pB6，pV和pVB6。
　　 研究方法：
　　 采用PCR方法克隆人VEGF基因cDNA的片段；将所克隆的基因片段插入pCR2.1-TOPO-TA载体中获得质粒pCR2.1-TOP0.VEGF，采用PvuⅠ和XhoⅠ双酶切，纯化目的基因片段后，插入pShuttle-IRES-hrGFP-1载体中获得质粒pShuttle-VEGF，再经NheⅠ和XhoⅠ双酶切，纯化目的基因片段后，插入质粒pEGFP-N1中获得质粒pV(pCMV-hVEGF)。
　　 采用PCR方法克隆人BMP-6基因cDNA的片段；将所克隆的基因片段插入pCR2.1-TOPO-TA载体中，经NheⅠ和EcoRⅤ双酶切，将目的基因片段纯化后，插入质粒pShuttle-IRES-hrGFP-1中，再经NheⅠ和XhoⅠ双酶切，将目的基因片段纯化后，插入质粒pEGFP-N1中获得质粒pB6(pCMV-hBMP-6)。
　　 采用PCR方法以pShuttle-IRES-hrGFP-1为模板，扩增IRES序列，经EcoRⅤ和PvuⅠ双酶切，将纯化后的目的基因片段插入pShuttle-VEGF中获得质粒pShuttle-IRES-VEGF。hBMP-6基因cDNA经NheⅠ和EeoRⅤ双酶切，目的基因片段纯化后，插入pShuttlc-IRES-VEGF载体中获得质粒pShuttle-hBMP-6-IRES-hVEGF，hBMP-6-IRES-hVEGF片段经NheⅠ和XhoⅠ双酶切，将目的基因片段纯化后，插入质粒pEGFP-N1中获得质粒pVB6(pCMV-hBMP-6-IRES-hVEGF)。所构建表达质粒均进行了双酶切鉴定和测序鉴定。
　　 结果：
　　 1.用PCR方法扩增出589bp的人VEGF基因的cDNA片段，经电泳鉴定目的基因片段长度正确。
　　 2.重组质粒pV经NheⅠ和XhoⅠ双酶切得到589bp目的片段和4.7kb大片段，电泳鉴定双酶切后所获得的酶切目的基因片段长度正确，经测序鉴定所有碱基，结果显示与目的基因序列完全一致。
　　 3.用PCR方法扩增出1554bp的人BMP-6基因的cDNA片段，经电泳鉴定目的基因片段长度正确。
　　 4.重组质粒pB6经NheⅠ和XhoⅠ双酶切得到1554bp目的片段和4.7kb大片段，电泳鉴定双酶切后所获得的酶切目的基因片段长度正确，经测序鉴定所有碱基，结果显示与目的基因序列完全一致。
　　 5.用PCR方法扩增出59yop的IRES基因的片段，经电泳鉴定目的基因片段长度正确。
　　 6.重组质粒pVB6经NheⅠ和XhoⅠ双酶切得到2738bp目的片段和4.7kb大片段，电泳鉴定双酶切后所获得的酶切目的基因片段长度正确，经测序鉴定所有碱基，结果显示与目的基因序列完全一致。
　　 结论：
　　 成功地构建了分别表达BMP-6，VEGF及BMP-6和VEGF的重组质粒pB6，pV和pVB6，为研究BMP-6、VEGF及BMP-6和VEGF联合在成骨作用中的作用奠定了基础。
　　 第二部分 BMP-6和VEGF在小鼠前成骨细胞系D1细胞中的表达和促成骨分化的体外研究研究目的：
　　 证明保存的克隆细胞系D1细胞具有干细胞特征；研究重组质粒pB6，pVand pVB6转染小鼠前成骨细胞系D1细胞后目的基因在mRNA和蛋白质水平的表达；并利用所构建的重组质粒pB6，pV和pVB6体外观察BMP-6、VEGF及BMP-6和VEGF联合在促进小鼠前成骨细胞系D1细胞成骨分化方面的诱导作用。
　　 研究方法：
　　 首先采用流式细胞术检测小鼠前成骨细胞系D1细胞表面标志，验证其是否具有干细胞特征。
　　 本部分实验分为6组：1)基本培养基组(DMEM加10％的胎牛血清)；2)成骨诱导培养基组(DMEM加10％的胎牛血清，50μg/ml维生素C，10 mM的β-磷酸甘油和10-7M的地塞米松)；3)pN组，pN转染组；4)pV组，pV转染组；5)pB6组，pB6转染组；6)pVB6组，pVB6转染组。经RT-PCR和ELISA方法对重组质粒pB6，pV和pVB6在D1细胞中目的基因的表达进行鉴定。
　　 采用SensoLyte®pNPP碱性磷酸酶试剂盒检测各组细胞的碱性磷酸酶活性，利用Von-Kossa染色检测各组细胞钙的矿化沉积和实时定量PCR法检测各组细胞成骨标志基因OCN和RunX2的表达量，并通过分析碱性磷酸酶活性变化、钙的矿化沉积程度及OCN和RunX2的表达量的变化判断目的基因对D1细胞促成骨分化的作用。
　　 结果：
　　 1.流式细胞术显示，D1细胞上CD44和SCA1的表达呈阳性，而CD34和CD45表达呈阴性，表明保存的克隆细胞系D1细胞属于干细胞。
　　 2.重组质粒pB6，pV and pVB6转染小鼠前成骨细胞系D1细胞后，用RT-PCR和ELISA可检测到重组质粒中目的基因在mRNA和蛋白质水平的表达。
　　 3.用SensoLyte®pNPP碱性磷酸酶试剂盒对碱性磷酸酶活性进行检测，结果显示pB6，pV组碱性磷酸酶活性显著高于对照组，而pVB6组碱性磷酸酶活性显著高于pB6和pV组。
　　 4.Von-Kossa染色结果显示pVB6组矿化沉积明显高于其他各组。
　　 5.实时定量PCR检测结果显示成骨标志基因OCN和RunX2表达pB6组显著高于对照组，而pVB6组显著高于pB6和pV组。
　　 结论：
　　 验证了D1细胞干细胞表面标志SCA-1和CD44的表达，证明D1细胞具有干细胞特征。通过RT-PCR和ELISA方法检测了重组质粒中目的基因在D1细胞中有相应mRNA和蛋白质表达。通过碱性磷酸酶活性检测、Von Kossa染色及实时定量PCR检测成骨标志基因的表达情况，证明了单独的BMP-6或VEGF在促进小鼠前成骨细胞系D1细胞体外成骨分化方面具有诱导作用，而且二者在促进D1细胞体外成骨分化方面具有协同作用。
　　 第三部分携带BMP-6和VEGF表达基因的组织工程骨的构建及其体内促成骨作用的研究研究目的：
　　 将所构建的重组质粒pB6，pV和pVB6转染小鼠前成骨细胞系D1细胞后种植到聚乳酸羟基乙酸(PLAGA)支架材料上，构建组织工程骨。体内观察BMP-6、VEGF对D1细胞介导的成骨作用的诱导作用，并观察BMP-6和VEGF在体内促进骨形成方面的协同作用。
　　 研究方法：
　　 采用聚乳酸羟基乙酸(PLAGA)支架材料，将细胞或质粒或转染质粒的细胞种植到支架材料上，形成组织工程骨，激光扫描共聚焦显微镜及扫描电镜观察D1细胞在PLAGA支架上的贴附及生长情况。
　　 将支架或组织工程骨放于小鼠皮下，体内观察其成骨作用。实验分为10组：(1)PLAGA支架组(P)；(2)D1细胞种植于PLAGA组(P+D1)；(3)pN种植于PLAGA组(P+pN)；(4)pN转染D1细胞种植于PLAGA组(P+D1pN)；(5)pV种植于PLAGA组(P+pV)；(6)pV转染D1细胞种植于PLAGA组(P+D1pV)；(7)pB6种植于PLAGA组(P+pB6)；(8)pB6转染D1细胞种植于PLAGA组(P+D1pB6)；(9)pVB6种植于PLAGA组(P+pVB6)；(10)pVB6转染D1细胞种植于PLAGA组(P+D1pVB6)。
　　 种植的支架在种植后的第2、3、4周取出并收集标本，所有标本的骨形成和血管形成的情况分别通过X-线，Micro-CT和组织学检测进行定性定量分析。
　　 结果：
　　 1.激光扫描共聚焦显微镜及扫描电镜观察结果显示D1细胞在PLAGA支架上贴附及生长良好。
　　 2.X-线结果显示，在第三周，P+D1pB6组和P+D1pV组成骨量显著高于对照组，而P+D1pVB6组成骨量明显高于P+D1pB6组和P+D1pV组，统计学分析显示有显著性差异o<0.05)；在第四周时P+D1pVB6组成骨量和P+D1pB6组没有显著性差异。
　　 3.Micro-CT结果显示，在第三周，P+D1pB6组和P+D1pV组成骨量显著高于对照组，而P+D1pVB6组成骨量明显高于P+D1pB6组和P+D1pV组，统计学分析显示有显著性差异(p<0.05)；在第四周时P+D1pVB6组成骨量和P+D1pB6组没有显著性差异。而且在第2、3周时骨形成首先在支架外侧，到第四周骨形成多时分布于整个支架。
　　 4.组织学HE染色结果显示，P+D1pVB6组骨量形成最多。
　　 5.组织学Von-Kossa染色结果显示，P+D1pVB6组矿化沉积量最多。
　　 6.血管染色结果显示，P+D1pVB6组有较多的血管形成，用HE染色进行定量分析，发现P+D1pVB6组和P+D1pV组的血管量显著高于其他各组，而P+D1pVB6组和P+D1pV组的血管量没有显著性差异。
　　 结论：
　　 证明了PLAGA支架适合转染和未转染的D1细胞贴附和生长。将重组质粒pV，pB6和pVB6转染D1细胞后种植于PLAGA支架上，构建了新的组织工程生物活性骨。经X线和Micro-CT检测，证明单独BMP-6或VEGF能诱导D1细胞介导的成骨作用，而且证明BMP-6和VEGF在诱导D1细胞介导的成骨作用方面具有协同作用，其促进骨形成从第二周即开始。组织学检测显示VEGF能促进血管形成，但与BMP-6相互作用后更能促进钙沉积和骨形成。

目录

文摘

英文文摘

TABLE OF CONTENTS

符号说明

前 言

第一部分：真核表达载体pB6,pV and pVB6的构建

材料和方法

结果

讨论

第一部分 总结

第二部分：BMP-6和VEGF在小鼠前成骨细胞系D1细胞中的表达及促成骨分化的体外研究

材料和方法

结果

讨论

第二部分总结

第三部分：携带BMP-6和VEGF表达基因的组织工程骨的构建及其体内促成骨作用的研究

材料和方法

结果

讨论

第三部分 总结

论文全文总结

参考文献

致谢

攻读博士学位期间发表的学术文章及获奖情况

学位论文评阅及答辩情况表

外文论文1

外文论文2