短发夹RNA干扰表达质粒与防粉已碱对大肠癌细胞LOVO/5-Fu多药耐药性逆转作用的比较

摘要

目的:大肠癌是一种常见恶性肿瘤，大肠癌病死率在西方国家位于恶性肿瘤死亡的第3位，仅次于肺癌和乳腺癌，在我国占恶性肿瘤死因的第5位，且发病率呈逐年升高趋势。早、中期大肠癌以手术治疗为主，晚期及术后复发患者，其主要治疗手段则为化疗。但是目前化疗疗效并不乐观，大肠癌化疗疗效显著降低的主要原因之一是由于肿瘤多药耐药性(multidrug resistance，MDR)的产生，尤其是大肠癌细胞的MDR原发性高表达及继发性高表达。MDR的特点是一旦对某种化疗药物产生耐药，则对结构、细胞作用靶点和作用机制均不同的抗癌药物都可产生交叉、广谱的耐药现象[1]。本研究通过比较短发夹RNA(short hairpin RNA，shRNA)干扰表达质粒与防粉己碱(Tetrandrine，Tet)对大肠癌LOV0/5-Fu细胞株MDRlmRNA的表达、P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)的表达、对细胞周期和凋亡率的影响、以及对化疗药物敏感性的影响，探讨shRNA干扰质粒和Tet大肠癌LOV0/5-Fu耐药细胞株的耐药性的逆转作用，以期找到一种逆转策略能更好的逆转肿瘤细胞的MDR，以指导临床用药。
　　 方法靶向MDR1的shRNA干扰质粒和Tet分别作用于人大肠癌多药耐药细胞株LOV0/5-Fu，噻唑蓝(MTT)法检测各组细胞对5-Fu的敏感性，流式细胞术检测细胞周期变化、凋亡情况及P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)的表达，实时荧光定量PCR(Realtime-PCR)检测各组细胞MDRl mRNA的表达水平，Western blot检测各组细胞P-gp的表达水平，并分析各组结果之间的差异。实验结果用SPSS10.0统计软件分析。
　　 结果:
　　 1、两种干扰因素作用后细胞对5-FU敏感性的变化：转染组[IC50=(2.38±0.45)mol/ml]比对照组[IC50=(7.27±0.34)mol/ml]的IC50显著降低(P＜0.05)，相对逆转率为72.7％;Tet作用组[IC50=(4.41±0.72)mol/ml]比对照组的IC50也明显降低，(P＜0.05)，相对逆转率42.5％。转染组和Tet作用组均低于对照组对5-Fu的RI。表明shRNA干扰质粒转染细胞和Tet作用后均在一定程度恢复耐药细胞对化疗药物5-FU的敏感性，且shRNA干扰质粒对LOV0/5-Fu耐药性的逆转作用更强。
　　 2、细胞周期的变化：与对照组细胞相比，转染组和Tet作用组细胞G1期增多(P＜0.05)，S期减少(P＜0.05)。提示抑制MDR1的表达后，更多的细胞被阻滞在G1期，进入分裂期的细胞明显减少，转染组阻滞效果更明显。
　　 3、各组细胞凋亡率的变化：对照组细胞的凋亡率为(1.32±0.47)％，转染组细胞的凋亡率为(5.88±0.44)％，两组凋亡率间差异有显著性意义(P＜0.05)；Tet作用组细胞的凋亡率为(3.24±0.26)％，与对照组细胞的凋亡率间差异有显著性意义(P＜0.05)；转染组与Tet作用组细胞间的凋亡率差异有显著性意义(P＜0.05)。
　　 4、P-gp表达结果：转染组细胞P-gp[(61.6±4.85)％]明显低于对照组细胞的P-gp的表达率[(96.9±2.25)％]，差异具有统计学意义(P＜0.05)；Tet作用组细胞P-gp表达率为(76.6±3.62)％，明显低于对照组细胞的P-gp的表达率，差异具有统计学意义(P＜0.05)。转染组与Tet作用组细胞间的P-gp表达率差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　 5、细胞MDR1基因的表达：转染组细胞的RQ(Relative Quantitation)值为(232.98±81.04)，与对照组细胞(1462.00±161.17)相比，MDR1表达量明显降低，差异具有统计学意义(P＜0.05)；Tet作用组细胞的RQ值为(569.99±85.15)，与对照组组细胞相比，MDR1表达量明显降低，差异具有统计学意义(P＜0.05)。转染组细胞的RQ值小于Tet作用组细胞的RQ值，两组之间比较差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　 6、Western blot检测P-gp蛋白：转染组与Tet作用组细胞的P-gp蛋白表达明显低于对照组细胞。转染组细胞的P-gp蛋白表达明显低于Tet作用组细胞的P-gp蛋白表达。说明转染靶向MDR1的shRNA干扰质粒和经过Tet作用后均可在一定程度上降低LOV0/5-FU多药耐药细胞的P-gp蛋白表达，shRNA干扰质粒对P-gp的抑制强于Tet。
　　 结论:
　　 1、shRNA干扰质粒和Tet体外均能逆转人大肠癌多药耐药细胞株LOV0/5-Fu的MDR。
　　 2、shRNA干扰质粒和Tet逆转人大肠癌多药耐药细胞株LOV0/5-Fu的机制均与MDRmRNA、P-gp蛋白的下调有关。
　　 3、shRNA干扰质粒比Tet能更有效的逆转人大肠癌多药耐药细胞株LOV0/5-Fu的MDR。