TGF-β1对hUCMSCs基因表达谱、增殖和细胞外基质表达的影响

摘要

目的:
　　 1.检测EGF、bFGF、HGF、PDGF和TGF-β1对hUCMSCs增殖和迁移能力的影响。
　　 2.检测TGF-β1对hUCMSCs基因表达谱、增殖和细胞外基质表达的影响
　　 方法:
　　 1.利用植块法从人新鲜脐带中分离培养MSCs。取第5代稳定生长的hUCMSCs用流式细胞仪进行免疫表型鉴定。取第5～7代稳定生长的hUCMSCs分别置于成骨细胞和成脂肪细胞诱导培养基中进行诱导分化来鉴定hUCMSCs多向分化能力。
　　 2.取第5代对数生长期细胞,对照组加入不含任何因子的普通培养基,5组实验组分别加入浓度均为2ng/ml的EGF、bFGF、HGF、PDGF和TGF-β1的培养基,培养24h后采用WST法检测490nm波长处测吸光值(OD值)。分组同前,采用体外细胞划痕损伤模型和Transwell培养体系检测并比较五种生长因子对hUCMSCs迁移能力的影响。
　　 3.取第5代对数生长期细胞,以1×105/ml密度接种于25cm2的培养瓶。对照组为普通培养基,实验组加入浓度为0.1ng/ml的TGF-β1,培养24小时后,加入1mlTrizol一步法提取总RNA。利用cDNA芯片技术检测hUCMSCs在TGF-β1作用下基因表达谱的变化。
　　 4.取第5代对数生长期细胞,八个实验组分别加入浓度为0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、和20.0ng/ml的TGF-β1,对照组为普通培养基。分别培养24、48、72个小时后采用WST法检测490nm波长处OD值。取第5代对数生长期细胞,三个实验组分别加入0.1、0.5和1.0ng/ml的TGF-β1,对照组为普通培养基。培养24小时后,实时定量PCR检测hUCMSCs细胞外基质mRNA表达情况。采用免疫组化的方法检测TGF-β1对Col-Ⅰ、Col-Ⅳ、FN和LN表达的影响。
　　 结果:
　　 1.1原代培养细胞7d后显微镜下可见明显粘附培养瓶壁生长,成纤维样,有伪足伸出,有折光性、核仁明显,15天时细胞达到70％～80％融合,形态变为均一的纺锤形。传代后细胞4～5个小时左右即可贴壁,传代2～3次后能获得形态均一的细胞,排列具有明显的方向性,呈放射或旋涡状生长。
　　 1.2根据流式细胞仪检测结果,所获得的贴壁细胞不表达CD34和CD45,高表达CD44、CD71、CD90和CD105。
　　 1.3碱性磷酸酶染色和茜素红S染色证实细胞可向成骨细胞分化;细胞内出现油红O阳性的脂肪颗粒说明细胞可向脂肪细胞分化。
　　 2.1在细胞检测中,实验组hUCMSCs较对照组细胞数均是增加的。在各实验组中,HGF组细胞数最多。
　　 2.2在细胞划痕损伤实验中,hUCMSCs在实验组培养基中培养迁移24h后,其迁移距离较对照组均是增加的,其中HGF组迁移距离最长。
　　 2.3在Transwell移行实验中,各实验组膜下的细胞数较对照组均增加,其中bFGF组膜下的细胞数最多。
　　 3.差异表达基因共有296个,其中上调基因153个,下调基因143个,其中在上调基因中有9个基因与细胞运动、迁移相关。通过差异基因的Pathway和Go的统计分析,显示差异基因涉及转录、翻译、生物合成、代谢、信号转导、细胞迁移、细胞间连接等多方面。
　　 4.1在细胞增殖实验中,随着TGF-β1浓度的上升,OD值并未呈现明确的量效关系,而是呈波浪样变化,变化均不显著。各时间段OD值在0.1ng/ml组均会出现相对峰值。
　　 4.2在qRT-PCR试验中,Col-Ⅰ、MMP-2、MMP-9和TIMP-2的表达在0.5ng/ml组达到峰值。其它成分:Col-Ⅳ、FN、LN、Integrin、Tenascin-C、MMP-1和TIMP-1均在0.1ng/ml组达到峰值。
　　 4.3在免疫组化实验中,Col-Ⅰ和Col-Ⅳ分别在0.5ng/ml组和0.1ng/ml组少量表达.FN在0.1ng/ml和0.5ng/ml组均强烈表达,二者无明显差异。LN在0.1ng/ml和0.5ng/ml组均无明显表达。
　　 结论:
　　 1.2ng/ml的EGF、bFGF、HGF、PDGF和TGF-β1均能促进hUCMSCs增殖和迁移。
　　 2.TGF-β1对hUCMSCs的转录、翻译、生物合成、代谢、信号转导、细胞迁移、细胞间连接等多方面在基因水平上具有调节作用并能通过上调肌动蛋白、微管蛋白、RhoA的基因表达来提高hUCMSCs的迁移能力。
　　 3.0.1ng/ml的TGF-β1在24h～72h中各时间段均能相对较好的促进hUCMSCs的生长。不同浓度的TGF-β1分别能促进ECM不同成分表达。