新型载基因自组装聚离子复合物胶束的研究

摘要

基因治疗被认为对各种基因疾病如传染病、与基因相关的紊乱和癌症的治疗具有巨大的潜力,因而受到广泛关注。开发安全高效的基因运送载体是实现基因治疗的关键之一。病毒载体转染效率高,但其在体内有一定的免疫原性和潜在的致癌性,使临床应用受到一定限制。非病毒载体易于制备、低毒、低免疫反应,安全性好但转染效率较低。如何获得高效的非病毒载体成为目前的研究热点。
　　 在非病毒基因载体中,利用嵌段共聚物自组装形成的聚离子复合物(polyioncomplex,PIC)胶束,是目前广泛应用于基因药物的一种非病毒载体。PIC胶束具有以下优势:①胶束的核能够作为带电化合物如DNA和酶的载体;②可选用生物可降解材料,安全性好;③纳米级的粒径且粒径分布窄、体内循环时间长;④制备简单、制备过程都在水溶液中进行,避免了有机溶剂的使用和残留;⑤易引入靶向因子等。因此本课题分别选择两嵌段共聚物PEG-b-PLL,三嵌段共聚物PLA-PEG-PLL,新型合成类脂-阳离子聚合物DOPE-g-PLL-b-PEG作为载体材料,以增强型绿色荧光蛋白质粒基因(pEGFP)作为报告基因,采用自组装技术制备出三种不同类型的PIC胶束,其一是PEG-b-PLL/DNA自组装形成PIC胶束;其二是PLA-PEG-PLL/DNA自组装形成环状PEG修饰(PEG loop)的PIC胶束;其三是合成了新型类脂-阳离子聚合物DOPE-g-PLL-b-PEG,并与DNA自组装形成脂质(lipid)修饰的PIC胶束。对三种PIC胶束分别进行理化性质和生物学性质评价,以期筛选出低毒、安全、高效的基因载体,探索其作为基因载体的适用性和可行性。最后,以性质优良的DOPE-g-PLL-b-PEG为载体材料,DSPE-PEG-NH2提供活性基团,cNGR为靶向因子,制备cNGR主动靶向脂质修饰PIC胶束,探讨其作为靶向载基因自组装聚离子复合物胶束的应用前景。课题的主要研究方法与结果如下:
　　 一、PEG-b-PLL/DNA自组装PIC胶束的研究
　　 本研究利用两嵌段共聚物PEG-b-PLL与DNA通过自组装形成稳定的纳米复合物,即PIC胶束。透射电镜观察PIC胶束形态;Zetasizer3000粒度分析仪测定其粒径、粒度分布和zeta电位;并考察其抗核酸酶降解能力、血浆稳定性、细胞毒性及其在HepG2细胞中的转染情况。结果表明制备的PIC胶束外观圆整,呈类球形,大小均匀,平均粒径为150.3±5.5 nm,粒径分布指数为0.226,zeta电位为10.4±1.2 mV。PIC胶束在血浆中稳定,能保护DNA免受核酸酶降解的能力,无显著的细胞毒性,并能成功转染HepG2细胞,但与PEI/DNA复合物相比,其转染效率较低。在以后的研究中有待于进一步对其结构进行改善以获得更高的体外细胞转染效率。
　　 二、PLA-PEG-PLL/DNA自组装环状PEG修饰PIC胶束的研究
　　 与前一部分PEG-b-PLL/DNA自组装形成PIC胶束相比,本研究利用生物可降解三嵌段共聚物PLA-PEG-PLL为载体材料,增加了疏水PLA嵌段,旨在降低两嵌段共聚物的亲水性。PLA-PEG-PLL与DNA自组装形成环状PEG修饰的PIC胶束:内核为生物可降解材料PLA,起稳定纳米粒的作用;阳离子PLL压缩DNA,沉积到PLA内核上;PEG围绕在纳米粒周围形成的环状结构,能更好的稳定胶束体系。本部分选用PLA-PEG-PLL为材料,首先制备空白PLA-PEG-PLL纳米粒,由于阳离子聚合物PLL本身带正电荷,所得到的纳米粒荷正电,其zeta电位可达28.0±2.4 mV。然后通过自组装方式制备PLA-PEG-PLL/DNA纳米复合物,即环状PEG修饰PIC胶束。该环状PEG修饰PIC胶束呈球形或类球形,平均粒径为127.4±6.7 nm,zeta电位为14.9±4.3 mV,抗核酸酶降解能力强、血浆稳定性高,细胞存活率高,能够将绿色荧光蛋白基因成功的转入HeLa和HcpG2细胞,且不受介质中血清的影响,转染效率优于PEI/DNA复合物。因此,利用生物可降解三嵌段共聚物PLA-PEG-PLL制备的环状PEG修饰PIC胶束是一种具有应用潜力的非病毒基因载体。
　　 三、新型类脂-阳离子聚合物的合成及其自组装脂质修饰PIC胶束的研究
　　 疏水性的类脂材料DOPE能够增强纳米粒体系与内吞体膜的融合,穿透溶酶体或内涵体膜,增强基因转染效率。为进一步增强PIC胶束的基因转染效率,在PEG-b-PLL结构基础上引入具有膜融合磷脂特性的DOPE。PLL结构中具备多个活性氨基基团可为DOPE提供修饰位点,因此本研究采用DCC/NHS反应合成了新型类脂-阳离子聚合物DOPE-g-PLL-b-PEG,并分别合成了高、中、低三批不同DOPE接枝修饰率的材料,其修饰率分别为16％,30％,56％,以考察不同接枝修饰率对转染效率的影响。该类脂-阳离子聚合物与DNA通过电荷吸附作用自组装形成载基因纳米复合物,即脂质修饰PIC胶束(Lipid modified PolyionComplex Micelle,LPCM):DNA和聚阳离子PLL,形成内核,内核由脂质材料DOPE包覆,外层由亲水性的聚合物PEG包被。对其理化性质、抗核酸酶降解能力、血浆稳定性、细胞毒性及其在HepG2和HeLa细胞中的转染情况分别进行了考察。结果表明制备的LPCM外观圆整,呈类球形,大小均匀,粒径在150nm左右。LPCM在血浆中稳定,具有一定的抗核酸酶降解能力,细胞毒性低。在HepG2和HeLa细胞中,DOPE接枝修饰的聚合物比未修饰聚合物具有较高的基因转染效率(p＜0.05),DOPE接枝修饰率为30％的聚合物(LPCM30)显示出最高的基因转染效率,在HeLa细胞中的转染情况甚至优于阳离子聚合物PEI。因此,新型类脂-阳离子聚合物作为基因载体,与DNA自组装形成的脂质修饰PIC胶束,制备工艺简单,性能良好,综合了聚合物与类脂的优势,是具有良好应用前景的非病毒基因载体。
　　 四、cNGR主动靶向脂质修饰PIC胶束的研究
　　 本文设计合成了类脂-阳离子聚合物,与DNA自组装形成的脂质修饰PIC胶束,取得了相对较低的毒性和较高的转染效率,然而这种给药体系仍然不具备主动靶向特定细胞的能力。研究发现,天冬酰胺-甘氨酸-精氨酸(asparagines-glycine-arginine,NGR)序列小肽可特异靶向肿瘤血管上皮细胞CD13受体,纳米粒表面连接NGR肽后,与肿瘤新生血管上皮细胞过度表达的CD13受体特异结合,从而起到主动靶向和增强基因转染效率的作用。因此,本研究以DOPE30-g-PLL-b-PEG和DSPE-PEG-NH2为载体,然后利用可特异靶向肿瘤血管上皮细胞CD13受体的环六肽CNGRCG(cNGK)为靶向因子,制备载基因cNGR主动靶向LPCM(cNGR-LPCM)。对其相关理化性质,抗核酸酶降解的能力以及血浆稳定性进行考察。通过体外细胞毒性试验和基因转染实验对纳米粒在HUVEC细胞,HepG2细胞中的细胞毒性和转染效率进行初步评价。结果表明,所制备非靶向LPCM和cNGR-LPCM均呈球形或类球形,平均粒径分别为134.4±6.1nm和139.5±7.6 nm,粒径多分散指数分别0.214和0.132;zeta电位分别为6.6±3.4 mV和7.0±3.8 mV。非靶向LPCM和cNGR-LPCM均具有较强的抗核酸酶能力和血浆稳定性。体外细胞毒性实验表明,在转染剂量下,与PEI相比,cNGR-LPCM具有较低的细胞毒性(p＜0.05)。转染实验结果表明,在CD13阳性细胞HUVEC中,cNGR-LPCM的体外转染效率明显高于在非靶向LPCM,而在CD13阴性HepG2细胞中,两种LPCM没有显著差异(p＞0.05)。因此cNGR-LPCM具有较高的体外靶向性和转染效率,有望成为一种高效、低毒,且将治疗基因靶向运输到肿瘤新生血管部位的新型纳米载体。
　　 综上所述,新型聚离子复合物胶束可有效荷载和保护目的基因,细胞耐受性良好,体外转染效率较高,是具有一定开发前景的非病毒基因载体。