牛蒡寡糖脂质体的制备鉴定以及人a1,6岩藻糖基转移酶的初步研究

摘要

第一部分的研究内容为牛蒡寡糖脂质体的制备和鉴定，主要分为牛蒡寡糖含量测定方法的建立、牛蒡寡糖脂质体制备工艺及处方研究以及牛蒡寡糖脂质体理化性质鉴定三个方面的内容。
　　 实验目的：建立计算牛蒡寡糖脂质体的包封率的方法，优化制备牛蒡寡糖脂质体的配方，并对制备好的脂质体进行理化性质和稳定性的研究。
　　 实验方法：建立葡萄糖浓度测定的标准曲线，通过计算葡萄糖和牛蒡寡糖之间的换算因子来达到对游离牛蒡寡糖的测定，从而实现牛蒡寡糖脂质体包封率的计算；继而选用药脂比、有机相和水相比例以及磷脂和胆固醇比为考察因素，以包封率为主要考察指标设计正交实验来优化制备处方，并另行考察高压均质条件的优化，以此来优化牛蒡寡糖脂质体的制备方案；再对制备好的牛蒡寡糖脂质体进行理化性质和稳定性研究，包括形态的观察、粒径的测定、zeta电势的测定、通过包封率的测定研究不同储存条件下的稳定性等。
　　 实验结果：葡萄糖浓度测定的标准曲线为y=12.4051x+0.01428(R=0.99962)，线性范围为0.005-0.15mg/ml。牛蒡寡糖溶液的换算因子f为1.28。通过截留分子量为30KD的超滤离心管可以对牛蒡寡糖和脂质体进行很好的分离。牛蒡寡糖脂质体制备最优方法为薄膜分散法；制备最优条件为：药脂比1:6，有机相和水相体积比1:2，卵磷脂和胆固醇质量比4:1；高压均质最优条件为：压力800bar，循环数3。制备好的牛蒡寡糖脂质为粒径均匀的球状或近球状小囊泡，平均粒径为74.2nm，多相分散系数为0.582，用微电泳仪测得其zeta电势为-12.56mv，通过测定在常温和4低温保存下渗透率的变化确定在4下保存具有较好的稳定性。但稳定性仍有待改善。
　　 结论：实验中成功制备牛蒡寡糖脂质体，并对制备工艺、处方以及理化性质和稳定性作出了研究，该脂质体性质比较稳定，大小均匀，具有较高的包封率，可进行细胞学和动物活体实验，为其临床及后续应用奠定了基础。
　　 第二部分的研究内容为可溶性的人α-1，6岩藻糖基转移酶(α-1，6 FucT，FUT8)以及对抗该酶的多克隆抗体的初步研究。
　　 实验目的：运用三种不同的方法来表达可溶性的α-1，6岩藻糖基转移酶，以用于下游糖蛋白的合成，并为该酶催化和反应机制的研究提供底物支持。制备抗FUT8的多抗，为今后开发癌症的血清学诊断试剂打下基础。
　　 实验方法：本论文首先从人胃癌细胞MKN45细胞株中扩增出FUT8的cDNA，构建pET28a-sFUT8载体，转化至大肠杆菌(E.coli)进行大量表达。之后对表达得到的包涵体蛋白进行纯化、变性和复性研究，以纯化后的包涵体为免疫抗原四次免疫小鼠，制备多克隆抗体，并测定其效价。鉴于原核表达无可溶性目的蛋白获得，实验中又尝试了巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)和体外试剂盒表达α-1，6岩藻糖基转移酶，实验将FUT8基因(FUT8)克隆到pPIC9k质粒上，电转化入Pichia pastoris GS115菌株，筛选获得高拷贝的重组菌株，甲醇诱导表达FUT8。同时，我们将构建的pET28a-sFUT8载体利用试剂盒在体外进行转录和翻译，利用SDS-PAGE和Western Blot验证蛋白表达情况。
　　 实验结果：实验从MKN45细胞株中成功扩增得到FUT8的cDNA，并成功构建pET28a-sFUT8原核载体，原核表达获得FUT8的包涵体蛋白。我们利用纯化后的包涵体进行了多抗制备，得到效价在1:5000至1:10000之间的抗FUT8多抗，为癌症的血清学诊断试剂研究打下了基础。同时我们成功构建pPIC9k-FUT8真核表达载体，可溶性FUT8蛋白在毕赤酵母中成功表达。另外，pET28a-sFUT8载体在体外成功表达，得到了可溶性的FUT8蛋白，SDS-PAGE和Western Blot都验证蛋白成功表达。
　　 结论：本实验室成功构建了pET28a-sFUT8原核载体和pPIC9k-FUT8真核载体，并将其分别转化至大肠杆菌和毕赤酵母内进行表达，得到的FUT8目的蛋白。原核表达得到包涵体蛋白，真核表达和试剂盒体外表达都得到少量的可溶性FUT8蛋白，表达得到的可溶性α-1，6岩藻糖基转移酶可用于下游糖蛋白的合成，并为该酶催化和反应机制的研究提供底物支持。另外，实验中对抗FUT8的多克隆抗体进行了初步研究，为今后开发鉴别癌症的血清学诊断试剂打下基础。