F-18 FDG摄取、表皮生长因子受体与乏氧诱导因子-1α表达预测肿瘤疗效价值研究

摘要

研究背景：
　　 放化疗结合的治疗模式在肿瘤治疗中不可或缺，综合手术、分子靶向、基因治疗和基因增敏等治疗是当前肿瘤治疗的主要模式。放射线、细胞毒药物以及分子靶向药物与肿瘤细胞的基因和细胞因子之间的相互作用，治疗过程中，细胞中的基因和各种细胞因子的表达发生的相应变化与临床治疗疗效密切相关。准确、有效地评估和预测肿瘤放化疗的临床疗效，以便在治疗中适时、有效地更换治疗方案，在保证取得最佳疗效的同时避免严重的毒副反应的发生，真正做到肿瘤患者的个体化治疗具有重要临床意义，寻找和建立能客观有效地评价肿瘤联合治疗疗效的方法和技术意义重大。目前，有多种方法、技术可用于肿瘤疗效和预后的监测，如分子影像技术、肿瘤相关蛋白表达的检测等，但是，各种技术方法在肿瘤疗效评估和预测方面的指导价值仍需细致、深入地研究。
　　 正电子发射断层扫描/计算机断层扫描(Positron emissiontomography/computer tomography，PET/CT)是在活体上从分子水平研究细胞功能代谢以达到对疾病特异性诊断、疗效观察、或进行新药研制筛选的全新领域，是分子生物学、生物化学、数据图象处理等多学科融合的结果。分子影像技术利用核素标记的分子探针可无创性与胞内特定靶分子结合，使用PET、PET/CT等对核素发出的射线探测成像，具有高特异性、高灵敏度和高图像分辨率。通过PET/CT显像检测肿瘤细胞18F-FDG的摄取能反映肿瘤细胞的糖代谢，是目前最广泛应用的分子影像技术，对肿瘤诊断和疗效监测具有重要作用。
　　 表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)是原癌基因c-erbB1的表达产物，属受体型酪氨酸蛋白激酶(Receptor-type tyrosine kinase，RTK)，是跨膜糖蛋白，可分为胞外区、跨膜区和胞内区三部分。配体结合EGFR胞外区后促使EGFR胞内段同源或异源二聚体化，并活化胞内酪氨酸蛋白激酶(Tyrosine kinase，TK)，激活细胞内多条信号转导通路，如Ras/MAPK、PI-3K/AKT、JAKs/STATs等，参与调控细胞增殖、分化、凋亡等多种生物学过程。近年研究表明，EGFR与肿瘤发生、发展密切相关，EGFR通过受体的高表达或突变参与了肿瘤细胞增殖、凋亡抑制、侵袭、转移、血管生成及治疗抗拒等过程。EGFR与肿瘤的密切关系决定其成为肿瘤诊断和治疗的有效分子靶标，其表达水平也成为肿瘤预后指标。抗EGFR分子靶向治疗与放疗的结合正成为放射治疗研究的前沿和热点。
　　 乏氧是肿瘤细胞的基本特征。乏氧影响肿瘤细胞的生长、分裂、增生和增殖，凋亡和转移以及对化、放疗的敏感性，可改善肿瘤细胞乏氧的治疗，都是对病人有效和有益的治疗。乏氧诱导因子-1α(hypoxia induction factor，HIF-1α)因为其结构中的氧依赖性降解结构域(oxygen dependent degradation domain，ODDD)成为细胞对生长微环境中氧变化的灵敏感受器，HIF-1α可与核内的多种基因转录启动子上游的乏氧反应元件(hypoxia reaction element，HRE)结合，启动VEGF、GLUT、MMPs、cadherin、EMT、bcl-2、P21、P27等基因转录和表达，参与调节肿瘤细胞的局部浸润和转移、细胞增生、永久性增殖、肿瘤血管的生成和细胞增殖周期比率改变等生物学过程。HIF-1α分子参与调节肿瘤细胞的增殖、凋亡、转移等生物过程，广泛参与细胞内的多条信号传导通路的过度激活，而成为肿瘤诊断和治疗的重要靶标。
　　 研究目的：
　　 1、调查FDG PET/CT显像的肿瘤细胞F-18 FDG摄取在评估和预测放化综合治疗的近期疗效反应及预后中的意义和价值。建立利用FDG PET/CT技术预测放化疗后患者疗效的技术平台。
　　 2、检测肿瘤组织EGFR和HIF-1α蛋白表达与放化综合治疗近期疗效和预后相关性，比较EGFR和HIF-1α蛋白表达与F-18 FDG摄取在评估和预测放化综合治疗的恶性肿瘤患者的近期疗效和预后价值。
　　 3、研究HIF-1α与EGFR在肿瘤生长和放疗过程中的相互关系，了解HIF-1α和EGFR分子表达与放疗疗效之间的关系，为临床抗EGFR靶向治疗的应用提供指导意义。
　　 研究内容：
　　 1.F-18 FDG摄取评估和预测放化疗食管癌病人的近期疗效反应及预后选择未经手术治疗、接受根治性放化疗、随访资料完整的食管鳞状细胞癌病人入组；于治疗前、治疗中行PET/CT扫描，探索F-18 FDG摄取变化与放化疗反应和预后的关系。
　　 2.检测EGFR或HIF-1α分子肺癌的表达；比较F-18 FDG摄取和在评估和预测NSCLC放化疗的近期疗效及预后的价值。
　　 选择未经手术治疗、接受根治性放化疗、随访资料完整的非小细胞肺癌(NSCLC)病人入组；于治疗前行FDG PET/CT扫描；可获取的肺部肿物活检组织，比较18F-FDG摄取和EGFR或分子HIF-1α的表达在评估和预测肿瘤放化疗疗效的价值。
　　 3.检测EGFR和Ki67分子在复发性鼻咽癌表达，分析NPC复发前后肿瘤EGFR分子的表达与复发的关系。
　　 选择未经手术治疗、接受根治性放化疗、随访资料完整的5年内复发鼻咽癌(NPC)，检测原发和复发NPC肿瘤细胞EGFR的表达。
　　 4.研究EGFR与HIF-1α分子的表达与肿瘤放疗的相互关系。
　　 荷瘤裸小鼠单次大剂量放疗后动态获取肿瘤组织标本，从蛋白水平检测EGFR、HIF-1α、VEGFR、与p-Akt等分子的表达，从RNA水平检测EGFR与HIF-1α表达的动态变化，阐明放疗后HIF-1α与EGFR分子表达的变化。
　　 研究方法：
　　 1.FDG PET/CT显像及显像条件优化。
　　 采用静态显像法对未手术的食管癌和NSCLC病人行FDG PET/CT显像，利用感兴趣区技术(ROI)分析肿瘤病灶，计算肿瘤区域的最大标准化摄取值和平均标准化摄取值(SUVmax和SUVmean)。
　　 2.统计学方法：卡方检验、logistic回归、生存分析、COX比例风险回归模型和ROC方法等。
　　 3.免疫组织化学方法(IHC)及免疫印迹法(Western Blot)结合半定量分析检测肿瘤组织EGFR与HIF-1α蛋白的表达水平。
　　 4.细胞培养技术和体外二维放射治疗技术。
　　 5.实时定量RT-PCR方法检测放疗前、后肿瘤组织HIF-1α与EGFR RNA的表达变化。
　　 研究结果：
　　 1.F-18 FDG摄取评估和预测食管癌放化疗的近期疗效反应及预后。
　　 61例接受放化疗食管癌病人入组，放疗中位剂量6000cGy，化疗4-6周期，治疗完成后4-6周疗效评价达CR者5例，28例PR，24例SD，4例PD；全部病人于治疗前和治疗中行FDG PET/CT扫描，SUVmean由治疗前的8.26±2.14降至4.56±1.68(p=0.001)；FDG摄取降低率在33例CR+PR者中达49.4％±2.37，显著高于28例SD+PD者的37.9％±2.69(p=0.000)；5年随访疾病未进展病人的FDG摄取由9.72±1.73降至3.88±1.34，降低59.4％±13.4；而疾病进展病人的FDG摄取由7.86±1.71降至4.74±1.71，降低40.2％±12.5(p=0.000)；ROC分析显示以FDG摄取降低51％为截断值预测疾病进展的灵敏度达76.9％，特异度为79.2％，阴性和阳性预测值分别为95％和50％；治疗前、治疗中FDG摄取降低率达51％的病人中位无进展生存(PFS)和总生存(OS)均显著长于FDG摄取降低率未达51％的病人，COX比例风险回归模型分析显示，治疗前的临床T分期和肿瘤51％ FDG摄取降低是PFS，疾病特异性生存(CSS)和OS的独立预测因子。
　　 2.EGFR或HIF-1α分子在肺癌的表达，比较F-18 FDG摄取和在评估和预测NSCLC放化疗的近期疗效反应及预后的价值。
　　 64例接受根治性放化疗的ⅢA期NSCLC病人入组，治疗完成后4-6周行疗效评价9例CR，47例PR+SD，8例PD，1年内37例局部或远处进展，2年总存率26％；57.8％病人HIF-1α阳性表达，腺癌阳性率60％，鳞癌阳性率56.4％；60.9％病人EGFR阳性表达，腺癌阳性率60.0％，鳞癌阳性率61.5％，EGFR表达与肿瘤分化程度相关；40.6％病人HIF-1α与EGFR分子共表达阳性，HIF-1α与EGFR共表达阳性率在腺癌和鳞癌的阳性率均为66.7％，HIF-1α与EGFR表达呈显著性相关(r=0.627，p=0.000)；64例病人均FDG摄取SUVmax为9.26±2.40，FDG摄取与HIF-1α表达显著相关(r=0.586，p=0.000)，与EGFR表达呈弱相关，与放化疗疗效反应显著性相关；FDG摄取、HIF-1α与EGFR共表达是放化疗反应的预测因子；HIF-1α与EGFR表达与1年的局部无进展生存、1年无远处转移生存和2年总生存均呈显著性相关，FDG摄取与生存无相关关系；多变量分析显示阳性HIF-1α与EGFR共表达是1年无进展生存和2年总生存的唯一显著性危险因子。
　　 3.EGFR和Ki67分子在复发鼻咽癌的表达。
　　 40例未经手术治疗、接受根治性放化疗、随访资料完整的5年内复发的Ⅰ-Ⅳb期的鼻咽癌病人入组，检测原发和复发肿瘤细胞EGFR的表达差异及与Ki67分子表达的相关性。EGFR在表达原发和复发肿瘤细胞无显著性差异，且原发和复发肿瘤细胞EGFR的表达与K167分子均具有显著性相关关系(r=0.573，P=0.001和r=0.698，P=0.010)。原发和复发肿瘤细胞EGFR高表达病人的复发时间均显著短于EGFR低表达病人(P=0.010和P=0.022)。
　　 4.HIF-1α与EGFR的表达与肿瘤放疗的相互关系
　　 荷人肺腺癌A549皮下移植瘤的21只BALB/c裸鼠的HIF-1α与EGFR的蛋白水平和RNA水平的表达与肿瘤体积呈正相关；单次大剂量放疗2000cGy，于放疗前、放疗后2小时、6小时、24小时、48小时，蛋白印迹检测HIF-1α蛋白表达于放疗后2小时开始升高，6小时、24小时、48小时持续升高：EGFR蛋白表达从放疗前后无明显变化；定量RT-PCR检测放疗前后HIF-1α和EGFR的RNA水平无明显升高，二者之间也无相关性关系。
　　 研究结论：
　　 1.用FDG PET/CT指导接受根治性放化疗的食管癌病人的治疗，对于治疗前和治疗中FDG摄取降低率未达51％的病人(NPV为95％)应于治疗早期调整治疗方案；而对于治疗前临床T3-4期的病人即使治疗中FDG摄取降低率达51％以上也应该接受强化治疗或巩固治疗，或加强治疗后疾病监测，以防早期复发。
　　 2.ⅢA期NSCLC接受根治性放化疗的病人治疗前FDG摄取与HIF-1α、EGFR表达具相关性，HIF-1α与EGFR共表达阳性率达40.6％；FDG摄取与HIF-1α、EGFR表达都与病人接受放化疗疗效反应呈显著相关；HIF-1α与EGFR分子共表达是唯一可预测1年无进展生存和2年总生存的因子。由此可见，治疗前FDG免疫组化检测肿瘤活检组织HIF-1α与EGFR表达的预后价值要比治疗前PET/CT的无创性检测对病人的预后价值要大。
　　 3.根治性放化疗后复发鼻咽癌细胞表达高水平的EGFR分子是细胞对放化疗的保护性反应，与复发生存显著相关。
　　 4.大分割放疗对在蛋白水平HIF-1α表达进行调节，与细胞的存活率相关；而从RNA水平对EGFR表达的调节；肿瘤生长期和放疗后早期可见EGFR与HIF-1α蛋白表达具有相关性；EGFR蛋白在放疗前后的持续表达结果提示可以在放疗中及放疗完成后进行抗EGFR分子的靶向维持治疗，以提高疗效和改善预后。