Rho激酶抑制剂法舒地尔对Aβ诱导痴呆大鼠模型的保护作用及其机制研究

摘要

背景与目的:
　　 阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)即老年性痴呆，是一种老年慢性进展性中枢神经系统退行性疾病，以认知损害为主要临床表现。随着人类平均寿命的延长和社会人口老龄化的迅猛发展，AD对人类健康的危害变得日益严重。据统计，全球的老年痴呆病人超过2600万，其中中国已超过500万。在发达国家，AD是继心脏病、癌症、中风后的第4位死因。另外，AD治疗和护理费用昂贵。因此，AD的防治已成为当前亟待解决的重大医学和社会问题。然而目前AD的研究现状是：虽然关于AD的发病机制已提出了多种学说，但尚无定论，对AD的治疗也就更加缺乏有力的手段。因此，进一步探讨AD形成和发生、发展的病理过程，并根据发病机制寻找更加有效的治疗方法，是医学工作者面临的有力挑战。
　　 在众多的发病机制中，β淀粉样蛋白(β-amyloid protein，Aβ)异常沉积所导致的级联反应损伤学说得到了广泛的支持和论证；而在这一病理过程中，炎症扮演了重要角色。有研究证实，沉积的Aβ激活小胶质细胞和星形胶质细胞，释放炎症因子并产生活性氧簇(reactive oxygen specie，ROS)，从而拉开了炎症和氧化应激损伤恶性循环的序幕。上述炎症反应和氧化应激过程互相加重，并通过肿瘤坏死因子(TNF)受体信号级联途径激活核因子-κb(NF-κb)，启动凋亡因子和炎症因子转录，使得炎症损伤进一步加重，从而诱导神经元凋亡或死亡。因此基于上述的理论，如果能够阻断AD病理机制中Aβ诱导的炎症反应及其继发的病理过程，就有可能打破这种恶性循环，对AD起到保护和治疗的作用。
　　 Rho激酶抑制剂(Rho-kinase inhibitor)盐酸法舒地尔(Fasudil)最初是作为解除脑血管痉挛的药物应用于临床。而近年来研究发现，多种细胞均表达Rho激酶。因此，Rho激酶抑制剂除具有经典的抑制平滑肌收缩、扩张血管、改善脑循环的作用外，还具有抑制炎症、神经保护、维持血-脑屏障完整性、减少氧自由基形成和增加清除，以及调节和控制细胞的运动、移行、增生和分化、生成和死亡等多种作用。目前已有Rho激酶抑制剂治疗血管性痴呆的临床和动物实验研究，发现其对血管性认知功能障碍有改善作用；有Rho激酶抑制剂显著提高老年大鼠的学习、工作能力的动物实验；有Rho激酶抑制剂改善遗忘型轻度认知障碍(aMCI)患者记忆功能的研究。
　　 本研究制备Aβ1-42诱导的海马损伤大鼠模型，模拟AD的病理过程，两个剂量的Rho激酶抑制剂Fasudil治疗干预，观察Fasudil是否能够对抗Aβ1-42诱导的海马神经损伤、改善认知、对AD起到保护作用，并探讨其可能的抗炎、抗氧化及继发的抗凋亡机制；同时进一步验证了Aβ诱导AD的炎症机制。本实验拓宽了Rho激酶抑制剂的适用范围，为发现AD新的药物作用靶点奠定了基础，有可能部分逆转AD的病理过程。
　　 材料与方法:
　　 80只成年雄性Wistar大鼠(体重260～300g)随机分为对照组(假手术组)(Control)、模型组(Model)、Fasudil低剂量组(Fasudil-L)(5mg/kg/d)、Fasudil高剂量组(Fasudil-H)(10mg/kg/d)，每组各20只。模型组和两个治疗组采用侧脑室注射Aβ1-42的方法制备海马损伤模拟AD大鼠模型。无菌生理盐水将Aβ1-42溶解稀释成2ug/ul，37℃孵育72h变为聚集状态。通过脑立体定向仪向大鼠侧脑室注入聚集态的Aβ1-42μl(10μg)；对照组侧脑室内注射无菌生理盐水2ul。术前即分组开始给药，连续14天。Fasudil低、高剂量组分别每天给予Fasudil5、10 mg/kg，分两次腹腔注射给药；模型组、对照组给予等容积生理盐水。
　　 术后第9天进行Morris水迷宫训练，连续5天，术后第14天进行测试，观察各组大鼠学习、记忆功能的变化。水迷宫测试后，部分大鼠麻醉后4％多聚甲醛心脏灌注、取脑，制作病理标本。行HE染色、Nissl染色和电镜观察海马区神经细胞形态结构的变化，TUNEL染色观察神经元凋亡。免疫组织化学方法检测海马区NF-κb的核内表达。部分大鼠断头取脑制备海马匀浆，酶联免疫吸附法(ELISA)测定海马区炎性因子IL-1β、TNF-α的水平。比色法检测海马组织匀浆中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱苷肽过氧化物酶(GSH-Px)活性和丙二醛(MDA)含量。
　　 数据以均数±标准差(mean±SD)表示，采用SPSS17.0统计软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05认定差异有显著性。
　　 结果:
　　 1.水迷宫实验
　　 模型组和对照组相比较，学习和记忆成绩均低于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)。Fasudil高剂量治疗组与模型组大鼠相比较，学习和记忆成绩均明显改善(P<0.01)。Fasudil低剂量组与模型组比较，大鼠的学习、记忆能力差异无统计学意义(P>0.05)。
　　 2.海马区病理形态学
　　 2.1 HE染色：术后14d，对照组海马齿状回(DG)区神经细胞排列紧密，细胞层次多，染色分布均匀，细胞核大而圆，核仁清晰可辨。模型组和低剂量Fasudil组海马神经细胞层次明显减少，排列稀疏，部分细胞空泡变，可见细胞核深染、固缩，核仁偏移，胶质细胞明显增生。高剂量Fasudil组海马神经细胞较模型组排列整齐，细胞呈椭圆形或圆形，细胞脱失较少见，胶质细胞增生减轻，核仁清晰。
　　 2.2 Nissl染色：与假手术对照组相比，模型组大鼠脑海马CAl区Nissl染色浅，Nissl小体数量少，健康神经元密度低、神经细胞的活性较弱，神经细胞损伤较严重(P<0.01)。高剂量Fasudil(10 mg/kg)治疗14天后，能够明显逆转Aβ对神经元的损伤(P<0.05)。
　　 2.3超微电镜：对照组大部分神经元结构正常，胞核以常染色质为主，核圆，胞浆内可见丰富的细胞器。AD模型组大部分神经元衰退，细胞固缩，核膜凹凸或断裂，细胞器肿胀、减少、结构破坏。Fasudil高剂量治疗组与模型组比较，神经元损伤较轻，衰退的神经元较少；而低剂量Fasudil治疗组改善不明显。
　　 3.海马区TUNEL染色显示细胞凋亡的结果
　　 模型组大鼠海马DG区存在较多的TUNEL染色阳性细胞，即凋亡细胞(P<0.01)。Fasudil高、低剂量治疗后，大鼠海马DG区阳性细胞均较模型组有所减少，其中Fasudil高剂量组偶见阳性细胞(P<0.01)，低剂量组可见少量阳性细胞(P<0.05)。
　　 4.海马区细胞炎性因子水平的检测
　　 模型组侧脑室注射Aβ1-42造成海马区细胞IL-1β、TNF-α显著升高(P<0.01)；Fasudil低剂量组治疗后，IL-1β、TNF-α水平有所下降(P<0.05)，差异有统计学意义；Fasudil高剂量组治疗后，IL-1β、TNF-α水平明显下降(P<0.01)，差异均有统计学意义。
　　 5.海马区NF-κ b的表达
　　 模型组海马区细胞NF-κb的核内表达明显升高(P<0.01)，Fasudil低剂量组治疗后，海马细胞核内NF-κ b的表达有所下降，但尚无统计学意义(P>0.05)；高剂量组治疗后，海马细胞核内NF-κ b的表达明显下降(P<0.01)，差异有显著性。
　　 6.海马组织SOD、GSH-Px活力和MDA含量测定
　　 与对照组相比较，AD)模型组大鼠海马组织中GSH-Px(P<0.01)和SOD(P<0.05)的活性均有不同程度的下降，而MDA含量明显增加(P<0.05)。Fasudil高剂量(10mg/kg)治疗后，大鼠海马的GSH-Px(P<0.05)和SOD(P<0.05)这两种抗氧化酶的活性明显增加，而低剂量Fasudil(5mg/kg)对两种酶的活性均无明显影响。同时，高、低剂量Fasudil治疗后，有降低MDA含量的趋势，但差异无统计学意义。
　　 结论:
　　 1.Rho激酶抑制剂Fasudil能够改善Aβ1-42诱导的痴呆模型大鼠空间学习和记忆能力。
　　 2.侧脑室注射Aβ1-42后，大鼠海马区健康神经元密度明显减少，凋亡细胞数量明显增多；连续应用高剂量Rho激酶抑制剂Fasudil干预14d后，能够显著逆转Aβ诱导的神经细胞损伤。
　　 3.Aβ1-42侧脑室注射后，大鼠海马区IL-1β、TNF-α显著升高；Rho激酶抑制剂Fasudil治疗后，大鼠海马区的上述炎性指标明显下降，且高剂量组优于低剂量组，证明Rho激酶抑制剂Fasudil剂量依赖性的对抗Aβ诱导的炎性反应，具有较强的抗炎功能。
　　 4.Aβ1-42造成大鼠海马区的氧化应激损伤；Rho激酶抑制剂Fasudil能够增加抗氧化酶GSH-Px和SOD的活性，具有抗氧化、保护大鼠海马区氧化还原功能的作用。
　　 5.侧脑室注射Aβ1-42导致大鼠海马区与炎症和氧化应激相关的转录因子NF-κ b核内表达明显增加；而高剂量的Rho激酶抑制剂Fasudil能够有效的抑制NF-κb的核内表达，从而抑制NF-κ b的核转位和激活，减轻由其激活导致的神经损伤。
　　 6.综上，Rho激酶抑制剂Fasudil具有多重作用机制，有可能部分逆转AD的病理过程，成为抗AD药物研究的新方向。