二氮嗪对氯化锂-匹鲁卡品致痫大鼠海马神经元的保护作用

摘要

癫痫是神经系统常见的严重危害人类健康的疾病之一，给社会、家庭及患者都带来了沉重的负担。我国目前约有900余万癫痫患者，其中有25-30％为难治性癫痫。颞叶癫痫(temporal lobe epilepsy，TLE)是难治性癫痫中最常见的类型，虽然近年来对TLE的病因、病理及发病机制的研究取得了很大进展，但其发病机制目前仍未完全阐明，通常的药物及手术治疗常难以获得明显的疗效。氯化锂-匹鲁卡品致痫大鼠的行为学、脑电图改变及海马神经元损伤的病理学改变均与人类颞叶癫痫相似，因而此模型是目前研究癫痫持续状态(status epilepticus，SE)和TLE的常用的模型之一。反复癫痫发作或SE能造成神经元损伤已被广泛认可，但反复癫痫发作导致神经元损伤的具体分子生物学机制目前仍不十分清楚，并且到目前为止仍未找到特别有效的具有神经保护作用的药物。因此进一步探讨癫痫的病因及发病机制，寻找新的具有神经保护作用的药物，具有重要的理论意义和现实意义。
　　 线粒体ATP敏感性钾通道(mitochondrial ATP-sensitive potassium channel，mitoKAP通道)是存在于线粒体内膜上的一种钾通道，具有双重生理作用。一是维持线粒体内K+平衡，从而控制线粒体基质容积的改变；二是在线粒体氧化磷酸化产生能量的过程中，通过K+的再摄取可以部分补偿质子泵产生的电荷转移，从而维持跨膜电位差和pH梯度的稳态。mitoKATP通道开放，K+内流，膜去极化，减轻线粒体内钙超载，基质容积增加，后者可增加ATP合成，促进线粒体呼吸。在mitoKATP通道发现后，其对缺血-再灌注的保护作用逐渐成为研究的新热点，研究的对象有心肌、脑、脊髓、肾脏、肝脏、肺等。在缺血再灌注动物模型中，mitoKATP通道开放剂二氮嗪(diazoxide，DZ)、吡那地尔等均可模拟缺血预处理的保护作用，mitoKATP通道阻断剂5-羟基癸酸(5-hydroxydecanoate，5-HD)可阻断这种保护作用。其保护作用的机理被认为与缺血预适应产生的保护作用相似。
　　 癫痫发作与缺血再灌注的病理生理过程有很大区别但是又有很多共性。mitoKATP通道开放剂对癫痫发作导致的脑损伤是否具有保护作用目前研究还很少。为此，本课题建立氯化锂-匹鲁卡品致痫大鼠模型，观察癫痫发作后海马神经元损伤的病理学及分子生物学特征；观察DZ对大鼠癫痫发作后海马神经元超微结构以及自由基代谢的影响，并检测线粒体凋亡通路相关蛋白水平的变化，以探讨mitoKATP通道开放剂DZ对癫痫发作后神经元是否具有保护作用及其可能的保护机制。本研究分三个部分：
　　 第一部分氯化锂-匹鲁卡品大鼠颞叶癫痫模型的建立及行为学、脑电图、海马神经元损伤的病理学观察
　　 目的：
　　 建立氯化锂-匹鲁卡品诱发的大鼠癫痫模型，观察大鼠的行为学、脑电图及海马组织病理学的改变。
　　 方法：
　　 健康成年雄性Wistar大鼠经腹腔注射氯化锂-匹鲁卡品诱发癫痫持续状态(status epilepticus，SE)，观察大鼠的行为学变化。SE持续60 min以后腹腔注射地西泮终止发作。于致痫后4h对大鼠进行脑电图(electroencephalography，EEG)描记；于癫痫发作后48 h以多聚甲醛灌注取脑，石蜡包埋切片，采用HE染色和Nissl染色观察大鼠海马神经元的损伤情况；之后每天观察记录大鼠有无自发性痫性发作(spontaneous recurrent seizures，SRSs)。
　　 结果：
　　 1.行为学表现：根据Racine评分标准，达到Ⅳ-Ⅴ级发作的大鼠被认为是诱发SE成功，表现为双侧前肢的阵挛、抽搐及全面性强直-阵挛发作，双侧后肢强直伴身体直立、躯干背曲强直、跌倒。氯化锂-匹鲁卡品诱发大鼠SE的成功率为85.41％，潜伏期为37.5±17.8 min，72 h内死亡率为31.7％。平均静止期为13.6±6.4天。有78％的大鼠观察到每周1-3次Ⅰ级到Ⅴ级的不同形式的自发性发作，发作形式基本同急性期，但持续时间较短暂，每次一般持续10-50秒，很少超过1min。
　　 2.EEG结果显示癫痫发作后4h(急性期)大鼠皮层和海马深部电极均可记录到丛集性棘波放电。
　　 3.HE染色和Nissl染色结果显示：正常大鼠海马CA1区和CA3区锥体细胞排列整齐，紧密，细胞结构清晰完整，细胞核正常，染色质分布均匀，胞浆内尼氏小体丰富。SE后48 h大鼠海马的CA1区和CA3区可见部分神经元丢失，排列不整齐，细胞轮廓模糊，结构不清，可见部分神经元胞体皱缩，核固缩，胞浆深染，胞浆内尼氏小体减少。
　　 结论：
　　 根据氯化锂-匹鲁卡品腹腔注射后大鼠的行为学和EEG改变以及海马组织病理学的改变，说明氯化锂-匹鲁卡品可致大鼠急性、慢性癫痫发作，氯化锂-匹鲁卡品致痫后可引起大鼠海马神经元的损伤。
　　 第二部分线粒体ATP敏感性钾通道开放剂二氮嗪对氯化锂-匹鲁卡品致痫大鼠海马神经元超微结构与自由基的影响
　　 目的：
　　 观察mitoKATP通道开放剂DZ对氯化锂-匹鲁卡品致痫大鼠海马神经元超微结构与自由基的影响，以探讨DZ对癫痫发作后神经元的保护作用及其机制。
　　 方法：
　　 成年雄性Wistar大鼠随机分为对照组、癫痫组(PILO组)、DZ组(DZ组)、DZ+5-羟基癸酸(5-HD)组(DZ+5-HD组)，用氯化锂-匹鲁卡品制作SE模型，模型制作前，DZ组用DZ5mg/kg，腹腔内注射，DZ+5-HD组先用5-HD8mg/kg，腹腔内注射，然后用DZ5mg/kg，腹腔内注射。观察各组大鼠行为学变化。分别在SE后4h、24 h、48 h断头取脑，分离海马，检测海马中丙二醛(malondialdehyde，MDA)的含量及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)的活力。于SE后48 h大鼠被断头取脑，分离海马，电镜观察海马神经元的超微结构；另一部分大鼠以多聚甲醛灌注取脑，采用Nissl染色观察大鼠海马神经元的损伤情况，并测定CA1区与CA3区神经元的存活数。
　　 结果:
　　 1.DZ能明显延长大鼠癫痫发作的潜伏期，降低癫痫发作急性期的死亡率。
　　 2.Nissl染色结果：与对照组比较，PILO组大鼠Nissl染色显示海马CA1区和CA3区神经元损伤和丢失明显(P<0.05)，与PILO组及DZ+5-HD组比较，DZ组大鼠神经元损伤和丢失程度明显减轻(P<0.05)。
　　 3.透射电镜观察结果：PILO组与DZ+5-HD组神经元损伤明显，可见神经元数目明显减少，细胞肿胀、破裂，胞核内染色质凝聚，细胞器减少，线粒体肿胀，结构破坏，嵴缺失，重者线粒体明显空泡化。DZ组神经元损伤明显减轻。
　　 4.大鼠SE后海马中MDA的含量升高(P<0.05)，SOD、GSH-Px活力下降(P<0.05)。DZ能明显降低大鼠SE后海马中MDA的含量(P<0.05)，升高SOD、GSH-Px的活力(P<0.05)。
　　 5.DZ的保护作用能被5-HD阻断。
　　 结论:
　　 DZ可通过降低大鼠癫痫发作后自由基的水平，提高抗氧化系统的反应性，减轻氧化应激损伤，从而减轻神经元的损伤与丢失，起到神经保护作用。
　　 第三部分线粒体ATP敏感性钾通道开放剂二氮嗪抑制癫痫大鼠海马神经元的凋亡
　　 目的:
　　 观察mitoKATP通道开放剂DZ对氯化锂-匹鲁卡品致痫大鼠海马神经元线粒体凋亡通路相关凋亡因子的影响，迸一步探讨DZ对癫痫大鼠神经保护作用的机制。
　　 方法：
　　 应用腹腔注射的方法建立氯化锂-匹鲁卡品(PILO)诱导的大鼠SE模型。实验大鼠在检测海马凋亡相关蛋白水平变化时分为对照组、SE后24h、72h、5d组；在检测DZ对海马神经元保护作用时分为对照组、PILO致痫72h组(PILO组)、DZ预处理组(PILO+DZ组)、DZ+5-羟基癸酸(5-HD)预处理组(PILO+DZ+5-HD组)。SE后分别在相应时间点灌注取脑，采用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediateddUTP nick end-labeling，TUNEL)法检测细胞的凋亡；断头取脑，分离海马，应用免疫印迹法(Western blot)检测大鼠海马Bcl-2、Bax、活性caspase-3的蛋白的水平及细胞色素C(cytochrome c，cytC)由线粒体到胞浆的释放。
　　 结果：
　　 1.与正常对照组比较，SE组大鼠在SE后各相应时间点TUNEL染色阳性细胞明显增加(P<0.05)。海马Bcl-2蛋白、线粒体中的细胞色素C(mito-cytC)的表达显著降低(P<0.05)，海马Bax、活性caspase-3蛋白及胞浆中的细胞色素C(cyto-cytC)的表达明显增高(P<0.05)。
　　 2.与PILO组及PILO+DZ+5-HD组比较，PILO+DZ组降低的海马Bcl-2蛋白水平显著升高(P<0.05)，而升高的海马Bax、活性caspase-3蛋白的水平明显降低(P<0.05)，cytC由线粒体到胞浆的释放减少(P<0.05)，TUNEL染色阳性细胞明显减少(P<0.05)。
　　 3.DZ的保护作用能被5-HD阻断。
　　 结论：
　　 DZ可通过开放mitoKATP通道，上调Bcl-2/Bax水平，减少cytC的释放，抑制caspase-3的激活，从而通过线粒体凋亡通路抑制氯化锂-匹鲁卡品致痫大鼠SE后海马神经元的凋亡，对癫痫发作所致的脑损伤具有神经保护作用，为癫痫的神经保护治疗提供了新的治疗靶点。
　　 研究意义：
　　 本研究应用氯化锂-匹鲁卡品腹腔注射制作大鼠颞叶癫痫模型，观察mitoKATP通道开放剂DZ对氯化锂-匹鲁卡品致痫大鼠海马神经元超微结构与自由基的影响，及线粒体凋亡通路相关凋亡因子的影响，首次证实了DZ可通过降低大鼠癫痫发作后自由基的水平，提高抗氧化系统的反应性，减轻氧化应激损伤，通过线粒体凋亡通路抑制大鼠SE后海马神经元的凋亡，对癫痫发作所致的脑损伤具有神经保护作用。尽管mitoKATP通道开放剂的神经保护作用机制仍需进一步探讨，但本研究结果仍有助于阐明癫痫发作致海马神经元损伤的机制及DZ对癫痫发作后神经元的神经保护作用的可能机制，为癫痫的神经保护治疗提供了新的靶点。