骨钙素化学发光免疫分析法的建立及初步临床应用

摘要

目的：本研究旨在建立稳定、敏感、特异的检测骨钙素的化学发光免疫分析法，为临床准确诊断疾病及预测疾病的预后、并进而采取相应的措施阻止或延缓疾病的发展进程提供客观的临床诊断依据；并对几种骨代谢疾病进行血清骨钙素水平的初步观察，探讨化学发光免疫分析法检测骨钙素浓度变化在骨代谢疾病中的临床意义。
　　 方法：本研究在方法学建立阶段主要从工艺配方和反应体系的优化与确定、方法学性能指标的分析、以及稳定性观察等方面进行了着手研究；而后在临床的初步应用中则注重对几种骨代谢疾病进行血清骨钙素水平的初步观察，探讨化学发光免疫分析法检测骨钙素浓度变化在骨代谢疾病中的临床意义。
　　 结果：
　　 1工艺配方研究
　　 本研究利用双抗体夹心法检测骨钙素原理，通过对固相包被工艺配方、封闭工艺配方进行探索和优化试验研究，最后选用0.05M pH9.5-9.7的碳酸盐缓冲液作为固相包被用缓冲液，2-8℃孵育20-22小时；洗板一次，去除结合不牢固的游离组份；再加惰性蛋白缓冲液于2-8℃孵育18-20小时以封闭非特异性空余位点，之后去除封闭液；在相对湿度30％以下的环境中干燥3-7个小时，用铝箔袋密封包装，于2～8℃条件保存。
　　 2反应体系的研究
　　 本研究还参照同类产品的反应模式对新建立骨钙素化学发光免疫分析法的反应体系进行优化试验研究，最后确定反应模式为：加入50μl校准品、质控品及待测样品到反应孔中，再加100μl测骨钙素酶结合物，混匀后置室温反应60分钟；用洗液沈板4次后，再用蒸馏水洗板一次，拍干；每孔加100μl等量混合的化学发光底物A液、B液(各50μl)，在5-20分钟内用化学发光免疫分析仪检测发光值(0.1秒/每孔)，判读结果。
　　 3分析性能研究
　　 在工艺配方和反应体系研究完成之后，本研究又针对骨钙素化学发光免疫分析法的分析性能进行评估研究，包括灵敏度分析、特异性分析、剂量反应曲线的线性、测定准确性、精密度等指标。通过对不同时间研制的不同批次的骨钙素化学发光免疫分析法成品的性能评估结果进行统计分析进而制定成品标准的指标设置，以有效地控制该方法的持续稳定。最终设定分析灵敏度即最低检出限不高于0.20ng/ml；特异性分析：与降钙素、甲状旁腺激素、胰岛素的交叉反应率应均小于0.01％；剂量-反应曲线的线性相关系数r应不低于0.9900；测定准确性：质控品的实测值与标示值的比值应在0.90-1.10之间；批内不精密度也即分析内不精密度以变异系数(CV％)表示应不高于10.0％，批间不精密度也即分析间不精密度以变异系数(CV％)表示应不高于15.0％。
　　 4初步临床应用
　　 本研究还利用该方法制备的骨钙素化学发光法试剂盒在我院进行初步的临床应用，观察不同病种，不同年龄组中血清骨钙素水平的差异。
　　 结论：
　　 综合整个研制过程及初步临床应用结果，本研究研制的骨钙素化学发光免疫分析法试剂盒用于骨钙素的检测，其灵敏度、准确性、线性、精密度、特异性、稳定性、临床灵敏度和临床特异性等指标均能满足临床需求，成功建立了稳定、敏感、特异的检测骨钙素的化学发光免疫分析法，为临床准确诊断疾病及预测、疾病的预后、并进而采取相应的措施阻止或延缓疾病的发展进程提供客观的临床诊断依据；对几种骨代谢疾病进行血清骨钙素水平的初步观察，也进一步证实了化学发光免疫分析法检测骨钙素浓度变化在骨代谢疾病中的临床意义，基本完成了本研究的预期目标。