透明质酸修饰载紫杉醇纳米脂质载体的研究

摘要

癌症严重危胁着人类的健康与生命，目前癌症的致死率逐年上升，居所有疾病中第二位。因此肿瘤的预防和治疗任务艰巨，目前化疗药物是治疗肿瘤的最有效手段。
　　 紫杉醇最早是从太平洋红豆杉的树皮中提取的一种四环二萜类化合物，是抗癌的首选药物之一。紫杉醇抗肿瘤的机制为:在细胞有丝分裂期促进微管聚合和抑制微管解聚，从而抑制细胞有丝分裂，使细胞停留在G2和M期，达到抑制肿瘤生长的目的。紫杉醇为水难溶性药物，限制了其临床的广泛应用，选择合适的载体，增加药物的溶解度，降低给药系统的毒性，是需要解决的首要问题。紫杉醇缺乏主动靶向性，对正常细胞同样具有杀伤作用，采用合适的载体，使药物靶向于肿瘤细胞，增加药物在肿瘤部位的浓集，可以提高药效，降低给药剂量，同时降低药物的不良反应。本课题构建透明质酸修饰载紫杉醇纳米脂质载体系统，首先采用纳米脂质载体包载紫杉醇，增加药物的溶解性，避免使用增溶剂，降低了给药系统的毒性;然后采用透明质酸作为靶向因子，经电荷吸附作用对纳米脂质载体进行靶向修饰，实现主动靶向肿瘤的目的。此体系具有以下优势:1）纳米脂质载体组成成分为脂质材料，生物相容性好，生物可降解;2）纳米脂质载体载药量高，粒径小，具有肿瘤被动靶向性;3）透明质酸为人体细胞外基质成分，生物相容性好，生物可降解;4）透明质酸与肿瘤表面过度表达的CD44结合使药物入胞，实现肿瘤主动靶向的目的。本课题的主要研究内容及结果如下:
　　 1.紫杉醇纳米脂质载体药物及包封率测定方法的建立
　　 本课题采用HPLC法测定紫杉醇的体外含量，方法学考察结果均符合要求。采用实验室建立的方法溶解-超速离心法分离游离药物与纳米脂质载体，用HPLC测定药物的包封率，方法学考察结果符合要求，回收率高，重现性好。
　　 2.紫杉醇纳米脂质载体的研究
　　 本课题采用熔融乳化-低温固化法制备紫杉醇纳米脂质载体(PTX-NLC)，采用甘露醇作为冻干保护剂，制备其冻干制剂，以长期保存。实验采用透射电镜观察PTX-NLC的粒子形态，采用Zetasizer3000考察其粒径和电位。结果显示最优处方下PTX-NLC呈球形，形态圆整，分散均匀，粒径为102.63±7.36nm，电位为70.57±5.17mV,包封率为91.99±0.71％，载药量为4.18±0.03％，冻干后药物的包封率为90.11±0.68％，粒径为140.9±7.51nm，电位为68.83±1.81mV。
　　 本部分的研究结果表明，PTX-NLC处方重现性好，冻干后PTX-NLC稳定，粒径变化不大，电位基本不变。
　　 3.透明质酸修饰紫杉醇纳米脂质载体的研究
　　 采用电荷吸附法制备透明质酸修饰紫杉醇纳米脂质载体(HA-NLC)。透明质酸含有羧基荷负电，PTX-NLC荷正电，采用电荷吸附法使HA吸附在PTX-NLC表面，获得主动靶向纳米脂质载体。筛选分子量分别为100万和30万的透明质酸，考察处方及工艺影响因素。
　　 4.透明质酸修饰紫杉醇纳米脂质载体的体外研究
　　 采用恒温振荡法考察透明质酸修饰前后紫杉醇纳米脂质载体的体外释药情况。结果表明，泰素(①)组释放符合Weibull数学模型，PTX-NLC和HA-NLC均符合双向动力学模型。采用三种肿瘤细胞:人结肠癌细胞系(HCT-116)，小鼠结肠癌细胞系(CT-26)和小鼠黑色素瘤细胞系(B16)，采用FITC标记抗CD44抗体对细胞表面的CD44表达量进行定量测定，然后考察透明质酸修饰紫杉醇纳米脂质载体的体外细胞毒性。结果显示，三种细胞表面的CD44表达量均在90％左右，空白HA-NLC基本无细胞毒性，空白NLC有细胞毒性，PTX-NLC细胞毒性较强，而HA-NLC毒性与PTX-NLC无显著性差异，但与泰素(①)组有明显的差异。空白的NLC表面含有阳离子型乳化剂CTAB，具有一定的细胞毒性，而空白HA-NLC基本无细胞毒性，表明HA的修饰掩盖了CTAB的细胞毒作用。
　　 5.体内药效学及药动学研究
　　 建立B16荷瘤小鼠模型，进行透明质酸修饰紫杉醇纳米脂质载体的体内药效学及药动学考察。与泰素(①)组相比，HA-NLC具有更好的体内抑瘤效果，二者具有显著的差异。与泰素(①)组相比，HA-NLC延长了药物在体内的循环时间。HA-NLC组在肝、脾和肺内的药物浓度增加，在心肾内的药量降低，可降低药物的心肾毒性。HA-NLC组在瘤内的总靶向效率Te由10.61％提高至14.46％，约提升了1.4倍，相对摄取率re为1.68，瘤内峰浓度Ce比为1.45。结果表明，HA-NLC增加了药物在肿瘤内的蓄积，具有明显的肿瘤主动靶向性。
　　 综上所述，PTX-NLC提高了紫杉醇的载药量，生物可降解，稳定性好。HA-NLC具有肿瘤主动靶向作用，体外药效学、体内药效学结果均显示HA-NLC具有明显的抑瘤效果，与泰素(⑩)组相比，降低了给药系统的毒性，提高了药效。因此，本课题制备的HA-NLC具有高效、低毒和肿瘤主动靶向的优势，具有一定的研发前景。