乳酸菌对食品中常见霉菌的抑制和黄曲霉素的去除

摘要

乳酸菌(Lactic acid bacteria,LAB)是一类形态、代谢性能和生理学特征不完全相同,可发酵碳水化合物产生乳酸的革兰氏阳性细菌的统称,它是一类重要的工业发酵微生物,在食品与饲料发酵,生物制药等领域有着广泛的应用。乳酸菌应用于食品和饲料发酵的历史悠久,但从上个世纪开始,人们才开始理解乳酸菌发酵在食物储藏中起作用背后的代谢过程,并且通过这些代谢过程产生生物防腐效应。随着人们对食品安全的关注和对食品品质要求的提高,生物防腐越来越受到重视,乳酸菌作为益生菌,在生物防腐方面具有其独特的优势,在安全性上,乳酸菌是传统的发酵菌株,是公认的安全级(Generally Recognized as Safe,GRAS)菌株;在提高食品风味方面,乳酸菌发酵所产生的乳酸及多种风味物质赋予食品良好的品质;在食品安全与健康方面,乳酸菌分泌的代谢产物细菌素或类细菌素可以防治某些传染性疾病。此外,乳酸菌是人和动物肠道的正常细菌,具有调节肠道菌群平衡、增强机体免疫力等作用,乳酸菌还有一个独特的特性即一些特定的乳酸菌可以利用物理吸附作用去除各种毒素,其中包括黄曲霉素等真菌毒素。可见乳酸菌及其代谢产物在生物防腐领域具有很好的应用潜力。因此本文从乳酸菌所具有的独特优势入手,筛选出3株具有广泛抑菌谱和较强抑菌能力的乳酸菌并进行菌种鉴定,研究它们菌种及发酵液的基本性质,用ELISA的手段测试这三株菌对黄曲霉素的吸附能力,研究它们的发酵液在葡萄常见病害防治和延长面包保藏期限中的应用潜力,对其中一株抑制霉菌的可能肽类物质进行了分离纯化,具体内容和成果如下:
　　1.乳酸菌的筛选及发酵液的基本性质
　　乳酸菌在发酵过程中,产生一些具有抑制其他微生物生长的代谢产物,具有生物防腐效应,因此,筛选产生具有较强抑菌活力的乳酸菌并测试其菌种及发酵液的基本性质是首要任务。由于近年来生物防腐的相关研究很多,但乳酸菌对霉菌抑制作用的研究相对较少,本文选择了筛选具有抑制霉菌生长能力的乳酸菌并研究其特性。本文以黑曲霉作为指示菌,从实验室保存的乳酸菌中,筛选出了3株具有广泛抑菌谱并且抑菌活性很强的乳杆菌2025b,2026b1,6-1-1,对它们进行16s rDNA测序,经Blast比对分析,鉴定乳酸菌2025b和6-1-1为发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum),乳酸菌2026b1为植物乳杆菌(Lactobacillus plantrum)。对其基本性质进行了详细研究,绘制了这3株乳酸菌的48h生长曲线和发酵36h的pH变化曲线,参考3株菌特点,确定乳酸菌培养15小时为菌体形态较好的稳定期前期,此时的乳酸菌菌体用于后续黄曲霉素吸附实验,培养36小时后乳酸菌生长达到稳定期中后期,发酵液中所含的抑菌物质达到最高点,此时的发酵液用于后续抑菌能力测试,食品保藏等实验及抑菌物质分离,测试3株菌对6株常见霉菌的抑制作用并绘制抑菌谱。检测其发酵液的温度稳定性发现100℃高温处理5min,3株乳酸菌的发酵液抑菌能力基本无影响。蛋白酶稳定性实验发现其中Lb.fermentum6-1-1发酵液的抑菌活性对蛋白酶敏感。储存稳定性实验发现Lb.fermentum6-1-1的发酵液随着储存时间的延长其抑制霉菌活力下降。
　　2.乳酸菌对黄曲霉的抑制和对黄曲霉素的物理吸附
　　黄曲霉素,是一族强力的致癌物具有致诱变性,致癌性,致畸形性,肝毒性和抑制免疫力性质的化合物,是一种剧毒物质,毒性比KCN大10倍,致癌力居首位,是目前己知最强致癌物之一,在食品中污染非常广泛。黄曲霉素是一些真菌的次级代谢产物(黄曲霉,寄生曲霉),食品和饲料中最常污染的黄曲霉素是黄曲霉素B1,B2,G1,G2四种,黄曲霉素M1,M2常见于牛奶污染,其中,黄曲霉素B1是这些化合物中毒性最强的一种,在食品中污染也最为广泛。一些乳酸菌及其代谢产物对黄曲霉生长具有抑制作用,许多乳酸菌菌体对黄曲霉素具有吸附作用。本章中检测了实验室筛选的13株乳酸菌对黄曲霉生长的抑制能力。并利用ELISA酶联免疫的方法,测试了3株乳杆菌2025b、2026b1和6-1-1菌体对黄曲霉素B1的吸附作用。结果表明,乳酸菌D52、D62和6-2-33株菌对黄曲霉生长抑制作用显著,菌株菌株6-1-1、2025b和2026b1对黑曲霉,米曲霉抑制作用效果较好。相对于对照菌Bacillus Natto,E.coli DH5α和乳酸菌MG1614,乳杆菌对黄曲霉素的吸附作用较强,其中,Lb.fermentum6-1-1对黄曲霉素的吸附效果非常显著,在实验条件下可以吸附60.69%溶液中的黄曲霉素B1。
　　3.乳酸菌发酵液在延长面包保藏期限和葡萄常见病害防治的潜在应用
　　近年来,乳酸菌应用于防腐领域的报道涉及面包烘焙、果蔬保藏、肉类保藏、青储饲料等方面。本文中测试了3株乳杆菌2025b,2026b1,6-1-1的发酵液在面包保藏延长保鲜期限的潜力,结果发现喷洒三株乳杆菌发酵液的面包其保鲜期均比对照延长,其中,菌株2026b1的发酵液效果最好。
　　葡萄贵妃玫瑰霜霉病防治实验表明,喷洒不同浓度的乳酸菌活菌制剂对葡萄贵妃玫瑰霜霉病都有防治效果,可以有效减少病叶数量和发病程度,当发酵液和水的比例以1:1比例混合时,其对葡萄贵妃玫瑰霜霉病的防治效果优于普通农药的对照组,从发病葡萄上分离出了三株致病霉菌,检测了乳酸菌制剂对它们的抑制能力,发现其中两株霉菌对乳酸菌的抑制敏感,一株霉菌对乳酸菌制剂的抑制作用效果较弱。
　　梅鹿辄葡萄炭疽病的防治实验中,相对于喷洒清水的对照组,不同浓度的活菌制剂对梅鹿辄葡萄炭疽病都有防治效果,而当发酵液和水以1:1的比例混合喷洒时,葡萄病粒比例为2.91%,低于正常用药对照组的3.82%,病粒数仅为正常用药组的76.17%。
　　4.抑霉菌肽类物质的分离纯化
　　乳酸菌的代谢产物中具有抑制霉菌能力的物质有多种,包括有机酸,蛋白类复合物,3-羟基丙醛,脂肪酸,苯乳酸,环肽及其他小分子物质等等,其中,蛋白及肽类抑制霉菌物质报道较少。本文中经蛋白酶作用后,Lb.fermentum6-1-1发酵液的抑菌作用减弱,可以推断含有的抑菌物质可能为蛋白质或小肽。使用C18液相色谱柱,对乳酸菌Lb.fermentum6-1-1发酵液中肽类或蛋白类物质进行分析和制备,并进行抑制霉菌的生物活性检测,发现含有抑制霉菌能力的物质。然而,SDS-PAGE和Tris-tricine SDS-PAGE不能从高效液相色谱分离出的物质中得到电泳条带,可能是由于样品浓度过低。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:缩略词表

第一章 绪论

1.1 乳酸菌对霉菌的抑制作用及应用

1.1.1 蔬菜保藏

1.1.2 青储饲料

1.1.3 面包储藏

1.2 乳酸菌对黄曲霉素的吸附作用

1.2.1 黄曲霉素

1.2.2 黄曲霉毒素中毒的化学预防

1.2.3 乳酸菌对黄曲霉素的吸附

1.3 乳酸菌产生的抑菌物质

1.3.1 有机酸

1.3.2 细菌素

1.3.3 蛋白质复合物

1.3.4 3-羟基丙醛

1.3.5 脂肪酸

1.3.6 苯乳酸

1.3.7 环肽和其他低分子量抑菌物质

1.3.8 其他终端产物

1.4 研究目的,内容和意义

第二章 乳酸菌对霉菌的抑菌谱及抑霉菌的基本性质

2.1 材料

2.1.1 菌株以及样品来源

2.1.2 培养基

2.1.3 试剂

2.1.4 仪器

2.2 方法

2.2.1 乳酸菌抑制霉菌能力测定方法

2.2.2 霉菌孢子液的制备

2.2.3 无菌浓缩乳酸菌发酵液的制备

2.2.4 抑制霉菌乳酸菌的初步筛选

2.2.5 乳酸菌个体形态的观察

2.2.6 乳酸菌染色体提取

2.2.7 16S rDNA序列测定

2.2.8 乳酸菌生长曲线的测定

2.2.9 乳酸菌生长过程中pH值变化曲线

2.2.10 抑霉菌物质的热稳定性和蛋白酶处理稳定性测定

2.2.11 浓缩发酵液储存稳定性实验

2.2.12 乳酸菌对常见霉菌的抑菌谱实验

2.3 结果

2.3.1 具有霉菌抑制能力乳酸菌的初步筛选

2.3.2 乳酸菌光学显微镜观察结果

2.3.3 乳酸菌菌种鉴定

2.3.4 乳酸菌的生长曲线

2.3.5 乳酸菌生长过程中pH值变化

2.3.6 抑霉菌物质的热稳定性和蛋白酶处理稳定性测定

2.3.7 浓缩发酵液储存稳定性

2.3.8 乳酸菌对常见霉菌的抑菌谱实验

2.4 讨论

第三章 乳酸菌对黄曲霉的抑制及其对黄曲霉素的吸附作用

3.1 材料

3.1.1 菌株及样品来源

3.1.2 培养基

3.1.3 试剂

3.2 方法

3.2.1 黄曲霉孢子的制备

3.2.2 乳酸菌对黄曲霉的抑制作用

3.2.3 乳杆菌菌体的制备

3.2.4 Bacillus Natto菌体和E.coli DH5α菌体的制备

3.2.5 乳酸乳球菌MG1614菌体的制备

3.2.6 乳杆菌对黄曲霉素的吸附

3.2.7 样品中黄曲霉素浓度的ELISA测定

3.3 结果

3.3.1 乳酸菌对黄曲霉的抑制作用

3.3.2 黄曲霉素标准曲线

3.4 讨论

第四章 乳酸菌发酵液在食物防腐和水果病害防治中的实际应用

4.1 材料

4.1.1 菌种及样品来源

4.1.2 培养基

4.1.3 试剂

4.1.4 仪器

4.2 方法

4.2.1 面包实验

4.2.2 葡萄病害防治实验

4.2.3 葡萄病源霉菌的分离

4.2.4 乳酸菌对致病霉菌的抑制作用的双层平板法检测

4.3 结果

4.3.1 面包实验

4.3.2 葡萄病害防治实验

4.3.3 乳酸菌对葡萄致病霉菌的抑制作用的双层平板法检测结果

4.4 讨论

第五章 乳酸菌发酵液中抑制霉菌有效物质的分离纯化

5.1 材料

5.1.1 菌株以及样品来源

5.1.2 培养基

5.1.3 试剂与器材

5.1.4 仪器

5.2 方法

5.2.1 无菌浓缩发酵液的制备

5.2.2 固相萃取

5.2.3 固相萃取小柱的选择和抑制真菌肽类物质的初步分离

5.2.4 抑菌能力的生物检测

5.2.5 乳酸菌6-1-1的无菌浓缩发酵液中肽类物质的高效液相色谱制备及生物检测

5.2.6 SDS-PAGE和Tris-tricine SDS-PAGE SDS-PAGE

5.3 结果

5.3.1 固相萃取小柱的选择和抑制真菌肽类物质的初步分离

5.3.2 抑制真菌肽类物质的制备和生物活性检测

5.3.3 SDS-PAGE和Tris-Tricine SDS-PAGE结果

5.4 讨论

参考文献

致谢

学位论文评阅及答辩情况表