斜卧青霉114-2中阿魏酸酯酶基因的表达与鉴定研究

摘要

阿魏酸酯酶是半纤维素降解酶系的组成部分之一。它可以通过水解半纤维素中木聚糖的部分侧链,从而打断半纤维素之间、半纤维素与木质素之间交联的网状结构,使木质纤维素的结构变得松散,有利于生物质的酶法降解和转化。阿魏酸酯酶还可以从木质纤维素材料中释放出酚类化合物,如阿魏酸、对香豆酸、咖啡酸及芥子酸。这些酚类化合物已经在食品、健康、化妆品、药物领域得到青睐,尤其是阿魏酸在生物学上具有吸收UV、抗氧化、抗炎等活性,已经广泛应用于医药、化妆品、食品、化工等行业。因此,阿魏酸酯酶在饲料、造纸、生物转化等多种行业都有广泛的应用前景。
　　本论文中,利用本实验室所筛选的一株纤维素酶高产菌株斜卧青霉114-2,在了解该菌株全基因组序列的基础上,希望鉴定其中的阿魏酸酯酶的基因,并通过克隆表达获得阿魏酸酯酶,以提高该菌株所产酶液对木质纤维素材料的降解能力。首先对已知的斜卧青霉114-2的基因组做BLAST蛋白序列比对,筛选查找出四个同源性较高的的阿魏酸酯酶基因序列。
　　其次,采用毕赤酵母GS115作为表达系统,将假定阿魏酸酯酶基因PDE06649进行了克隆与表达。结果发现:基因PDE06649在GS115中得到了有效的表达,并对该表达的蛋白做了酶学性质的分析。
　　为了避免因为糖基化或不正确的修饰所带来的外源蛋白活性的丢失,论文利用斜卧青霉尿嘧啶营养缺陷体M12作为表达载体,成功地构建了M12-09278、M12-09178、M12-08709的重组菌株,研究发现M12-09278重组菌能够表达目的蛋白09278,对09278蛋白的活性检测和蛋白序列BLAST分析,推测其可能是乙酰木聚糖酯酶。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:符号说明及缩略词

第一章 前言

1.1 阿魏酸酯酶的概述

1.2 阿魏酸酯酶的分类

1.3 阿魏酸酯酶在真菌基因组中广泛存在

1.4 阿魏酸酯酶的结构分析及作用机制

1.4.1 阿魏酸酯酶的一级结构

1.4.2 阿魏酸酯酶的3D结构

1.4.3 作用反应机制

1.5 阿魏酸酯酶与其他半纤维素降解酶系在半纤维素材料降解中的协同作用

1.6 阿魏酸酯酶及其酶解产物的应用

1.7 论文研究的目的与主要内容

第二章 斜卧青霉PDE 06649基因在Pichipastoris GS115中异源表达

2.1 实验材料

2.1.1 菌株和质粒

2.1.2 试剂、工具酶

2.1.3 培养基和溶液配制方法

2.2 实验方法

2.2.1 斜卧青霉114-2中基因PDE 06649的同源性分析

2.2.2 斜卧青霉114-2的总RNA的提取及目的基因的克隆

2.2.3 质粒pPIC9K的转化及提取

2.2.4 重组质粒pPIC9K-06649的构建

2.2.5 连接产物转化大肠杆菌感受态

2.2.6 重组质粒pPIC9K-06649验证

2.2.7 重组质粒pPIC9K-06649转化毕赤酵母

2.2.8 目的基因06649在毕赤酵母中的诱导表达

2.3 实验结果

2.3.1 斜卧青霉114-2的总RNA的提取及目的基因的扩增

2.3.2 质粒pPIC9K的提取

2.3.3 重组质粒pPIC9K-06649的验证

2.3.4 重组质粒pPIC9K-06649电转毕赤酵母及转化子的筛选

2.3.5 检测目的基因PDE 06649的表达结果

2.3.6 HPLC检测目的蛋白06649的活性

小结

第三章 阿魏酸酯酶相关基因在尿嘧啶营养缺陷型菌M12中的同源表达

3.1 实验材料

3.1.1 菌株和培养基

3.1.2 实验所用缓冲液及试剂

3.1.3 试剂、工具酶

3.2 实验方法

3.2.1 斜卧青霉114-2阿魏酸酯酶相关基因的BLAST分析

3.2.2 斜卧青霉114-2基因组的提取

3.2.3 质粒ANIp8的提取

3.2.4 重组载体ANIp8-09278,ANIp8-09178,ANIp8-08709的构建

3.2.5 重组质粒转化 E.coli感受态DH5α

3.2.6 大肠杆菌重组子的验证

3.2.7 M12菌株原生质体的制备及转化

3.2.8 重组菌M12-08278,M12-09178,M12-08709的筛选及鉴定

3.2.9 重组菌的目的蛋白09278,09178,08709的表达及活性检测

3.3 实验结果

3.3.1 斜卧青霉114-2中阿魏酸酯酶相关基因蛋白序列的BLAST结果

3.3.1 斜卧青霉114-2基因组的提取

3.3.2 目的基因PDE-09278,PDE-09178,PDE-08709的引物设计及PCR扩增

3.3.3 质粒ANIp8与目的基因的酶切连接

3.2.4 大肠杆菌转化子的验证

3.2.5 重组质粒转化M12及重组菌的筛选验证

3.2.6 目的蛋白09278,09178,08709的表达情况

3.2.7 HPLC检测09278蛋白的酶学性质

小结

全文总结及展望

参考文献

致谢

学位论文评阅及答辩情况表