NF-κB信号通路介导的TNF-α抑制骨髓基质细胞成骨分化过程中的作用研究

摘要

牙周病是口腔两大常见病多发病之一，是导致牙齿缺失的重要原因。它是以牙周袋形成和牙槽骨吸收为特点的细菌感染性炎性疾病，其特征是牙周支持组织（牙槽骨，牙骨质和牙周韧带）的炎症和破坏。牙周病治疗的最终目的是重建因炎症过程而破坏的牙周组织，恢复牙周组织的结构和功能，要求有新的牙槽骨和牙骨质及插入其中的胶原纤维的形成，即真正意义上的再生。而真正意义上的牙周再生应该是对发育过程中胚胎发生和形态发生的重演，其中干细胞的增殖与分化是决定牙周再生成功与否的关键因素。干细胞是一类具有自我更新和分化的潜能的细胞，其增殖和分化受多种内在机制和微环境因素影响。口腔是个细菌污染环境，而牙周病更是细菌感染性疾病，在牙周再生过程中，干细胞处于炎性微环境当中，其增殖和分化的调控很可能受到炎性因子的影响，现有大多数研究以成骨细胞系为研究对象，证实炎性因子能够影响成骨细胞特异性基因的表达、细胞基质的分泌以及成骨细胞的凋亡，但没有说明在干细胞向成骨细胞分化过程中炎性信号通路对成骨基因表达的调控作用。因此，在牙周病的病理和修复过程中，慢性、长期、高浓度的炎性微环境对于成体干细胞向成骨细胞分化影响机制的研究，将有助于我们了解炎症刺激下的成体干细胞的生物学特性，据此为临床研发新的更有效的牙周治疗方法开辟新的思路。
　　 核转录因子NF-κB广泛存在于真核生物中，是一个由复杂的多肽亚单位组成的蛋白家族。它作为信号传导途径中的枢纽，与免疫、肿瘤的发生、发展，细胞凋亡的调节以及胚胎发育等重要事件有着密切联系，是一种重要的核转录因子。NF-κB在细胞因子诱导的基因表达中起关键性的调控作用，它调控的基因编码急性期反应蛋白、细胞因子、细胞粘附分子、免疫调节分子、病毒瘤基因、生长因子、转录和生长调控因子等。通过调控多种基因的表达，NF-κB参与免疫反应、炎症反应、细胞凋亡、肿瘤发生、成骨分化等多种生物进程。有活性的DNA结合的经典NF-κB信号是一个二聚体（p50和p65的二聚体），静息状态下，NF-κB以无活性的潜在状态存在于细胞浆中，它与一种抑制因子IκB结合组成一个三聚体p50-p65-IκB。当细胞受到TNF、IL-1等炎性因子刺激时，IκB即从三聚体中解离出来，暴露出p50亚基上的易位信号和p65亚基上的DNA结合位点，从而使此异二聚物表现出NF-κB活性，并从细胞质中易位到细胞核中，与κB基序(κBmotif)相结合，从而发挥转录调控作用。在炎症的牙周微环境中，NF-κB在炎性因子的作用下，通过复杂的机制，发挥其转录调控作用，调控着各种上下游成骨基因的表达。
　　 近年来，有研究者提出NF-κB与BMP2和Runx2这两种成骨诱导因子存在相关性。骨形成蛋白BMP2不仅在体内可以引起骨的形成，而且在体外能引起间充质细胞的成骨分化，然而BMP2尚不能满足牙周病治疗中骨再生的临床应用，可能的原因是炎症因子抑制了骨再生和其诱导的成骨分化，目前绝大多数研究者认为TNF-α可通过NF-κB信号通路促进BMP2的表达，而BMP2可通过激活Smad途径，促进下游成骨效应分子表达。但也有研究表明TNF-α通过NF-κB信号通路抑制了成骨分化。这其中的确切机制的明确将有助于在炎症状态下骨缺损修复中成骨分化的诱导。
　　 在成骨分化的众多调控因子当中，Runx2被认为是成骨细胞分化的主控基因(mastergene)，在Runx2基因敲除的小鼠中成熟的成骨细胞和骨化完全缺失，仅能观察到一些只微弱表达ALP活性而不表达骨桥蛋白(osteopontin，OPN)和骨钙素(osteocalcin，OC)的不成熟成骨细胞。有证据显示TNF-α可以通过抑制Runx2而抑制前成骨细胞的分化，虽然确切机制尚有争议，但提示炎性因子有可能通过NF-κB信号途径在Runx2与其下游效应分子之间起到调控作用。
　　 因此，本研究以小鼠骨髓基质干细胞ST2为研究对象，分别过表达了NF-κB的两个不同亚基p50/p65，以及过表达IκB以阻断NF-κB信号通路。在体外经矿化诱导，观察过表达NF-κB是否重演了炎性因子对成骨分化的影响，阻断NF-κB是否消除了炎性因子对各成骨信号通路的影响。施加炎症刺激和成骨诱导，利用Dual-Luciferase双荧光素酶检测BMP-Smad信号通路、Runx2-BSP、Runx2-OSE信号通路是否由TNF-α通过NF-κB信号通路来调节。
　　 材料和方法：
　　 1.TNF-α对成骨诱导ST2细胞成骨基因表达的影响，及其对BMP2和Runx2促成骨作用的调控
　　 复苏冻存的ST2细胞，经传代后达到良好细胞状态后，分别施以成骨诱导液，TNF-α或/和BMP2;TNF-α或/和过表达Runx2质粒;诱导一定时间段后提取总RNA或/和总蛋白，采用RT-PCR和Westernblot法观察各成骨基因在ST2细胞中的表达，检测TNF-α对ST2细胞成骨基因表达的影响及是否调控BMP2和Runx2对下游成骨基因的促进作用。
　　 2.TNF-α及其下游NF-κB信号通路对BMP2-Smad信号通路的影响。
　　 稳定转染p65、p50、IκB、及其相应对照空载体到ST2细胞中，成骨诱导，TNF-α和/或BMP2作用后，在一定时间点收集细胞并提取总RNA，用RT-PCR法检测目的成骨基因的变化;瞬时共转染带有Smad结合元件启动子的SBE-luc和Renia荧光素酶到相应细胞中，TNF-α和/或BMP2作用后，检测荧光报告基因表达，判断BMP2对下游基因的转录控制是否被炎性因子TNF-α或NF-κB信号通路的阻断而影响。
　　 3.TNF-α对Runx2-BSP和Runx2-OSE信号通路的抑制是通过NF-κB信号通路实现的
　　 稳定转染p65、p50、IκB、及其相应对照空载体到ST2细胞中，再共转染质粒Runx2和带有BSP(或OSE)启动子的荧光报告基因和海肾荧光素酶到相应细胞中，施以TNF-α刺激，以不加TNF-α作对照，检测荧光值。比较TNF-α对Runx2-BSP和Runx2-OSE信号通路的抑制是否通过NF-κB信号通路实现。
　　 结果：
　　 1、TNF-α对ST2细胞成骨分化中BMP2和Runx2基因表达水平及其促成骨功能的影响
　　 作为未成熟的前成骨细胞，ST2细胞的成骨基因的表达有时空特点，其中BMP2、Runx2属于上游基因，矿化诱导早期就能高表达，OC，BSP属于下游基因。在矿化诱导的ST2细胞中，TNF-α提高了BMP2的表达，抑制Runx2，OC，BSP的表达，可不同程度地逆转BMP2和Runx2上调其下游靶基因OC，BSP表达水平的作用。
　　 2、TNF-a通过NF-κB信号通路促进BMP2的表达，但对BMP2-Smad信号通路无影响
　　 成骨诱导的阻断NF-κB信号通路的ST2细胞中，TNF-α对BMP2表达的促进作用被消除;但不影响BMP2对下游基因的调控，对BMP-Smad信号通路无影响。成骨诱导的过表达NF-κB信号通路的ST2细胞中，BMP2表达水平显著提高，再加入外源性BMP2之后，下游基因OC，BSP的表达有所提高，但不如对照组提高的幅度大;对BMP-Smad信号通路亦无影响。
　　 3、TNF-α通过NF-κB信号通路调节Runx2-BSP通路，但对Runx2-OSE启动子信号通路无影响
　　 在ST2细胞内过表达p50或p65可在ST2细胞成骨分化过程中降低Runx2的表达水平;过表达IκBα阻断NF-κB信号通路后，TNF-α抑制Runx2表达的作用被拮抗。在ST2细胞内过表达p50或p65可抑制Runx2对9.0kbBSP启动子的转录激活作用;TNF-α可抑制Runx2对9.0kbBSP启动子的转录激活作用，而通过过表达IκBα阻断NF-κB信号通路后，TNF-α的这一抑制作用被消除。TNF-α和NF-κB信号通路均不影响Runx2对OSE2的转录激活作用。
　　 结论：
　　 1.TNF-α上调了BMP2的mRNA表达，但其对BMP2促成骨功能的逆转或抑制最终掩盖了BMP2的促成骨作用，从而使得TNF-α，尤其是高浓度的TNF-α，对骨髓基质细胞的成骨分化的最终作用主要表现为抑制。
　　 2.在骨髓基质干细胞的成骨分化过程中，TNF-α及其激活的NF-κB信号通路虽然能够上调BMP2基因的表达水平，但是TNF-α显著抑制BMP2下游成骨效应蛋白的表达水平。这一抑制作用不是通过以GTCTAGACSmad结合序列为特征的BMP2-Smad信号通路完成的。
　　 3.在骨髓基质干细胞的成骨分化过程中，TNF-α及其激活的NF-κB信号通路抑制了Runx2基因的表达水平，同时通过NF-κB信号通路抑制了Runx2激活的BSP启动子的转录，但是并不影响Runx2激活的OSE2启动子的转录。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

第一部分 TNF-α对ST2小鼠骨髓基质细胞成骨分化过程中BMP2和Runx2基因表达水平及其促成骨功能的影响

材料与方法

结果

讨论

第二部分 TNF-α及其下游NF-kB信号通路对BMP2-Smad信号通路的影响

材料与方法

结果

讨论

第三部分 TNF-α及其下游NF-kB信号通路对Runx2基因表达水平及其促成骨调控功能的影响

材料与方法

结果

讨论

全文结论

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的学术论文目录

Morphology and distribution of neural elements in the regenerated periodontal ligament of dog premolars

Dose-specific effects of tumor necrosis factor alpha on osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells

学位论文评阅及答辩情况表