趋磁细菌Magnetospirillum magneticumAMB-1反硝化代谢与DNA损伤修复体系对磁小体合成及其遗传稳定性的影响研究

摘要

趋磁细菌是一类能在体内合成纳米级磁性矿物颗粒的兼性厌氧型原核生物，在自然界中分布广泛。趋磁细菌大部分分布在α，γ，δ变形菌门和硝化螺菌门，其生长环境为海水或者淡水的氧化还原交界面处，对生长环境的氧化还原状态要求较高。趋磁细菌由于能够通过生物矿化合成磁性颗粒——磁小体，所以可感受地磁场，在磁场的作用下进行定向游弋。磁小体在趋磁细菌体内排列成链状，而大大增大了菌体的总磁矩。磁小体结构均一，性能稳定，分散性好，在生物学、物理学、材料学上有非常广泛的应用。
　　 磁小体作为趋磁细菌体内一类特殊的物质结构，其合成机制、作用机制引起了许多学者的研究兴趣。目前已获得的研究成果表明，磁小体合成是受一系列基因编码产物的控制而完成的复杂过程。大致包括铁源的吸收、运输、运输过程中的代谢以及价态变化，磁小体膜的起源和内陷，磁小体晶核的生物矿化，以及成熟磁小体的链状排列等等。这些过程互相影响、互相渗透，在不同种类的趋磁细菌中展示出多样性和种属特异性，涉及多种目前未曾全面了解的复杂生理活动和代谢途径，且对环境因素影响敏感。同时，遗传学研究发现，与磁小体合成的有关基因有明显的结构组成特征，以基因岛的形式存在于趋磁细菌基因组中，在基因岛内又可分为几个大的基因簇。岛内基因簇之间以及基因岛两端都存在正向重复序列，推测这些正向重复序列通过与某些相关重组蛋白的相互作用，会导致基因岛以一定的频率进行重排，最终引起基因岛序列部分或者全部的丢失，从而造成菌体磁小体合成能力的遗传不稳定性。
　　 综上所述，磁小体合成过程可能会受到菌体多种代谢途径的影响。通过总结产磁过程中铁源的代谢研究成果，我们推测菌体内存在的反硝化蛋白组分可能与磁小体合成中铁价态变化过程相偶联。在趋磁细菌模式菌株MS-1(MagnetospirillummagnetotacticumMS-1)体内鉴定出了反硝化组分——硝酸盐还原酶和亚硝酸盐还原酶。通过对两种酶体外活性的研究发现，硝酸盐还原酶可能在微好氧条件下以及磁小体合成过程中的能量供应方面起作用。而亚硝酸盐还原酶具有一种与趋磁细菌相关的特异活性:二价铁:亚硝酸盐氧化还原酶活性。推测该酶在反硝化途径中参与了磁小体合成过程中铁源的氧化还原。基于上述两种酶的初步研究，我们推测趋磁细菌在以硝酸盐作为唯一氮源的培养条件下合成菌体所需蛋白质进行生长的同时，可偶联铁的氧化还原从而参与或影响磁小体合成过程。但是由于MS-1在厌氧条件下不能以硝酸盐作为唯一氮源进行生长，所以目前还不能确定MS-1体内有独立的反硝化系统存在。趋磁细菌AMB-1是趋磁细菌研究的另一模式菌株，与MS-1不同的是，其能够在厌氧条件下以硝酸盐为唯一氮源进行生长和产磁。
　　 作为兼性厌氧微生物，趋磁细菌在氧气存在条件下进行生长，但是氧在体内代谢产生的活性氧也同时会对菌体产生毒害作用，这种作用主要表现在对蛋白、核酸等生物大分子的损伤。我们曾在趋磁细菌模式菌株，淡水趋磁螺菌AMB-1(MagnetospirillummagneticumAMB-1)中报道了三个过氧化还原酶，研究发现它们在活性氧自由基的清除与磁小体合成能力遗传稳定性的维持方面发挥重要作用。尤为重要的是这些酶组分的缺失会明显提高菌体在传代过程中基因组磁小体岛的丢失频率。因此，趋磁细菌的氧化抗逆性途径可能在好氧条件下维持磁小体基因岛遗传稳定性方面起作用，但是具体作用机制并不清楚。在趋磁螺菌MSR-1(Magnetospirillumgryphiswaldense)中，重组酶RecA可以通过重组活性参与磁小体基因岛遗传过程中大片段的丢失，是磁小体岛遗传不稳定性的直接原因之一。
　　 本文以淡水趋磁螺菌AMB-1为实验材料，对两个方面进行了研究。第一，AMB-1反硝化代谢途径的分析鉴定以及功能验证。基于对趋磁细菌体内铁源代谢以及价态变化的推测，对AMB-1中反硝化途径在细胞能量供应和对磁小体合成过程的影响进行了探讨。第二，针对AMB-1的磁小体合成过程及可能的影响因素，通过转座诱变对AMB-1进行突变筛选，探索了磁小体岛外与其生理代谢功能相关的基因在磁小体合成过程中的作用。通过对一个DNA损伤修复基因功能失活突变菌株的研究，探讨了DNA损伤修复系统在高氧化压力的环境下对AMB-1磁小体基因岛以及菌体产磁功能的影响。具体工作内容和创新性研究结果如下:
　　 1.对AMB-1亚硝酸盐还原酶的编码基因进行预测和功能分析，探讨了该酶在AMB-1反硝化代谢以及磁小体合成过程中的作用。
　　 通过AMB-1基因组的生物信息学分析，获得了三个可能的亚硝酸盐还原酶编码基因:amb1395、amb1408、amb4165。在建立体外酶活测定方法的基础上，对该酶在菌体内的活性分布和产酶适宜条件进行摸索。结果表明，亚硝酸盐还原酶酶活在菌体静置培养状态下的周质空间组分中分布较高。对静置培养的AMB-1周质空间组分进行分离纯化，得到电泳纯的活性纯蛋白组分。质谱鉴定结果表明，该蛋白的编码基因为AMB-1基因组中的amb1395。
　　 通过荧光实时定量PCR进行的转录分析表明，amb1395在静置培养条件下转录水平明显高于振荡培养条件，并且在静置培养条件下，amb1395的转录水平在磁小体合成阶段明显升高，说明该基因的表达产物与磁小体的合成密切相关。但采用单交换插入策略对amb1395进行了功能失活后，功能失活突变株的生理表型却显示，菌体在厌氧条件下的生长和磁小体合成与野生型相比均无明显区别。这些结果表明，虽然该酶在趋磁细菌AMB-1的反硝化代谢及磁小体合成过程中不发挥主要作用，但可能参与了上述过程。另外，由于该酶的催化底物亚硝酸盐对菌体有毒性，推测菌体内应该存在其他途径组分能够分解亚硝酸盐，导致菌体在缺失amb1395之后没有明显的表型变化。
　　 2.通过对AMB-1在不同氮源条件下的生长以及对硝酸盐还原酶基因的预测分析，确定了反硝化途径对AMB-1在厌氧条件下的生长及产磁过程的重要性。
　　 AMB-1能够以硝酸盐作为唯一氮源进行生长。硝酸盐在体内可以通过铵化作用供应菌体大分子物质的合成。以铵盐作为唯一氮源的生长实验表明，菌体在好氧振荡条件下能够正常生长，但是在静置培养或者厌氧条件下生长则受到明显抑制，这说明铵盐在静置或厌氧条件下不能完全代替硝酸盐。结合MS-1中的研究，可以推测在AMB-1体内可能存在依赖于硝酸盐的厌氧产能途径。通过生物信息学分析，在AMB-1基因组中存在一个硝酸盐还原酶编码基因，amb2690。在建立其体外酶活测定方法的基础上，对amb2690进行了插入失活。发现硝酸盐还原酶功能失活突变株在以硝酸盐作为唯一氮源的有氧培养条件下可正常生长，但不能在厌氧条件下生长和产磁。在以0.3L/min的流速通入空气的恒定通氧发酵条件下，菌体能够在获得氧气的基础上进行生长，此时菌体的铁吸收水平和磁小体合成水平不受影响。这些结果说明反硝化途径可能仅在厌氧条件下作为趋磁细菌AMB-1生长和磁小体合成过程的能量来源，与磁小体合成过程并没有特异性的联系。当有氧气存在时，反硝化途径的功能丧失对菌体生长和产磁过程没有影响。
　　 3.DNA损伤修复体系UvrABC在好氧条件下具有维持AMB-1磁小体岛遗传稳定性的重要作用。
　　 利用转座子对AMB-1进行随机插入突变，获得了一株产磁异常突变株。该突变株的生长与野生型AMB-1没有明显差别，但是磁小体合成能力明显低于野生型。通过分子生物学鉴定，发现该突变株的DNA损伤修复蛋白复合体UvrABC的UvrA亚基编码基因uvrA被转座子插入导致其功能失活。进一步对uvrA的定点插入失活研究表明，该组分的功能缺失使得菌体在恒定通氧发酵条件下的产磁能力受到不可逆的损伤。突变株经过好氧培养后，保留产磁能力的菌体只占群体的38％左右（野生型AMB-1的产磁菌体达94％）。同时，产磁菌体的平均磁小体合成数目也明显降低，突变株平均为1-4个，远低于野生型的8-20个。通过荧光定量PCR分析发现，突变株在好氧条件传代过程中，磁小体岛基因拷贝数与基因组其他区段基因拷贝数的比值明显降低，突变株子代的磁小体岛拷贝数在经20次左右的传代后仅为突变株原始菌株的20-30％，而同样条件下的野生型AMB-1子代能保持初始菌株的80％。这表明突变株的磁小体岛遗传稳定性在UvrA缺失的情况下明显下降。进一步转录分析表明，突变株中的重组酶基因recA转录水平明显高于野生型AMB-1，达到AMB-1的11.9倍。recA的插入失活可以降低因UvrA功能失活而引发的磁小体岛区域的不稳定性。因此，uvrA缺失菌中recA转录活性的上升可能是导致磁小体岛遗传稳定性下降的原因。通过以上实验，我们认为UvrABC体系的功能丧失会造成趋磁细菌在好氧条件下DNA随机损伤的积累，这种损伤积累到一定水平能够导致基于RecA蛋白的同源重组修复途径的激活而引发基因组磁小体岛遗传稳定性的降低。该研究结果进一步补充和完善了有关前期研究所证明的趋磁细菌AMB-1氧化抗逆能力的存在是维持磁小体岛遗传稳定性的重要因素的观点。