异染色质蛋白HP1α和核纤层蛋白A生物学功能研究

摘要

异染色蛋白1(Heterochromatinprotein1，HP1)是结合在异染色质上的一个蛋白，对于基因的转录调控、端粒的沉默与加帽、肿瘤的发生等紧密相关。HP1具体生物学功能仍存在许多未知的领域，人们普遍关注于它在异染色质层次上的功能研究。本课题研究旨在揭示HP1α在染色质低级结构方面的生物学功能，主要从组蛋白、组蛋白和DNA复合物、核小体三个层次去研究其生物学作用，从而揭示异染色质的形成过程。
　　 本论文主要运用了GST-HP1α的pulldown技术、交联剂BS3交联技术、Westernblot技术、生物素标记DNA技术、电泳迁移率实验(ElectrophoreticMobilityShiftAssay，EMSA)等方法来研究这三个层次。本论文的研究揭示了HP1α可能起着一个分子伴侣的作用，协助组蛋白二聚体组装到组蛋白四聚体和DNA复合物上，并起着一定的稳定核小体的作用。HP1α对于不同的组蛋白变体的作用强弱亦不相同，比如HP1α对于H2A.Z-H2B二聚体结合能力强于H2A-H2B二聚体，而HP1α能促进H2A核小体的形成，却对H2A.Z核小体的分子伴侣能力较弱。H3.3变体对于HP1α结合能力的影响不是很显著。综上所述，HP1α在核小体形成过程中可能起到一定的分子伴侣作用，但具体功能还受组蛋白变体影响，机制比较复杂，还需要我们进一步的研究探索。
　　 在细胞核内，异染色质是通过DNA和核纤层蛋白(Lamin)结合而锚定到核膜。儿童早衰综合征是LaminA基因发生了一个碱基的突变，形成了一个隐蔽剪切位点，导致LaminA前体在翻译后修饰时不能正常被切割而形成了截断蛋白progeria。端粒DNA与人类的衰老更是密切相关，端粒3'悬突富含多个重复G序列，在一定条件下可以形成G四联体(G4)的结构。G4结构的形成抑制了端粒对端粒酶的招募，使得端粒末端无法延长，抑制了肿瘤的发生。根据我们前期研究，G4和LaminA都与衰老紧密相关，两者之间是否有一定的联系，这是本课题研究的出发点。
　　 本研究主要采用了圆二色谱仪色谱分析技术、EMSA技术和AlphaScreen技术研究两者之间的相互作用。结果表明，LaminA对G4结构有特异性结合作用，而对于打乱序列的单链DNA结合能力较弱;加入潜在端粒酶抑制剂RHPS后，这种特异性结合受到了抑制。综上所述，本研究的结果可能对揭示LaminA、G4与儿童早衰疾病的的发生和肿瘤产生的分子机制具有重要的意义。

目录

声明

摘要

缩略词

第1章 文献综述

1．1 异染色质

1．1．1 异染色质结构的结构与形成

1．1．2 异染色质与癌症

1．2 异染色蛋白1的研究进展

1．2．1 异染色质蛋白1简介

1．2．2 异染色质蛋白1与癌症

1．3 核纤层蛋白A

1．3．1 核纤层蛋白A的结构

1．3．2 核纤层蛋白A与儿童早衰症

1．4 端粒和四连体DNA

1．4．1 端粒及其端粒酶

1．4．2 四联体DNA

1．4．3 G4和肿瘤的发生、衰老

1．5 本实验研究的目的和意义

第2章 HP1α蛋白的表达及小片段DNA的制备

2．1 实验材料

2．1．1 实验菌株与质粒

2．1．2 工具酶

2．1．3 试剂

2．1．4 试剂配方

2．1．5 主要仪器

2．2 方法

2．2．1 异染色质蛋白1α的表达纯化

2．2．2 质粒的大量提取和DNA片段的纯化制备

2．2．3 制备生物素标记的DNA片段

2．3 结果与讨论

2．3．1 异染色质蛋白1α的表达纯化

2．3．2 质粒的大量提取和DNA片段的纯化制备

2．3．2 制备生物素标记的DNA片段

第3章 组蛋白的纯化及八聚体的构建

3．1 主要实验仪器和药品

3．1．1 菌株与载体

3．1．2 实验仪器

3．1．3 试剂配方

3．2 方法

3．2．1 组蛋白H2A、H2A．Z、H2B、H3．1、H3．3、H4的大量表达

3．2．3 组蛋白二聚体、四聚体和八聚体的组装

3．3 结果

3．3．1 组蛋白H2A、H2A．Z、H2B、H3．1、H3．3、H4的大量表达

3．3．1 组蛋白二聚体、四聚体和八聚体的组装

第4章 HP1α生物学功能的研究

4．1 实验材料

4．1．1 主要试剂及仪器

4．1．2 主要药品的配制

4．2 实验方法

4．2．1 GST-HP1α的pulldown实验

4．2．2 His-HP1α和组蛋白的交联实验和Western blot检测

4．2．3 DNA-组蛋白复合物和核小体的组装

4．2．4 非变性电泳检测

4．2．5 生物素检测

4．3 结果与讨论

4．3．1 组蛋白和HP1α结合实验

4．3．2 组蛋白-DNA复合物和HP1α结合实验

4．3．3 核小体和HP1α结合实验

4．4 小结

4．5 总结与讨论

第5章 核纤层蛋白A与G4相互作用研究

5．1 实验材料

5．1．1 实验菌株与质粒

5．1．2 试剂

5．1．3 试剂配方

5．2 实验方法

5．2．1 LaminA蛋白纯化

5．2．2 G4的制备

5．2．3 G4的EMSA实验

5．2．4 圆二色谱实验

5．2．5 AlphaScreen实验

5．2．6 AlphaScreen竞争实验

5．3 实验结果

5．3．1 LaminA蛋白纯化

5．3．2 CD检测G4结构

5．3．3 G4结合LaminA的EMSA实验

5．3．4 G4结合LaminA的AlphaScreen实验

5．4 实验结果总结与讨论

参考文献

致谢

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