IKIP通过靶向IKKβ负向调节NF-κB介导的炎性细胞因子的表达

摘要

机体免疫系统中，固有免疫在抵抗外来病原微生物感染中发挥重要的作用，固有免疫细胞通过模式识别受体(PRR)识别微生物结构上高度保守的病原相关分子模式（PAMP），然后经过一系列的信号级联反应来调控不同效应分子的表达。其中TOLL样受体(Toll-like Receptors，TLRs)作为重要的模式识别受体受到广泛的关注，用相应的配体如LPS，PGN等刺激固有免疫细胞后，TLRs细胞膜内侧TIR(Toll/IL-1 receptor homologous region)结构域募集MyD88，TRAF6，IKKβ等接头分子，最终促进NF-κB等转录因子的活化，活化的转录因子与相应的反应原件结合后，诱导大量的炎性细胞因子、趋化因子等的产生，从而促进炎症反应的发生。其中TLR4(Toll-like Receptor 4)和TLR2(Toll-like Receptor 2)识别LPS和PGN后可以通过活化NF-κB的方式促进IL-6，TNF-α等细胞因子的表达，其产生的炎性细胞因子在清除病原微生物感染中发挥重要的作用，但是TLRs的过度活化以及相应炎性细胞因子的过度产生，将引发一系列与炎症相关的疾病，尤其是自身免疫性疾病。因此，对促炎性细胞因子产生的机制研究显得尤为重要。
　　 IκB激酶结合蛋白（IKK-interacting Protein, IKIP）是人类近期发现的一个新分子，经过基因剪切后形成3个转录体，并翻译成相应的蛋白分子发挥功能。有报道称，X射线照射能促进IKIP的表达，在内皮细胞中，p53可以调控IKIP的表达，在细胞凋亡过程中发挥重要功能，作者通过酵母双杂交的实验发现IKIP可以与NF-κB上游的激酶IKKβ结合。由于IKKβ介导NF-κB活化的途径在TLRs信号通路中同样发挥着重要作用，因此IKIP是否参与TLRs信号通路，以及是否可以通过影响IKKβ进而调控NF-κB介导的炎症反应都有待进一步研究。
　　 研究目的:
　　 1、检测LPS，PGN等TLRs配体刺激巨噬细胞后，IKIP的表达量是否发生变化;
　　 2、探讨IKIP是否影响LPS，PGN等TLRs配体诱导的促炎细胞因子的表达;
　　 3、探讨IKIP调控TLRs信号通路中的NF-κB活化的分子机制。
　　 研究方法:
　　 1、 LPS，PGN刺激巨噬细胞，检测IKIP的表达。
　　 C57/B6小鼠腹腔注射淀粉(6％)，72小时后，取出诱导产生的的原代腹腔巨噬细胞(Macrophage)，经LPS，PGN刺激0、2、4、8、12、24h，Trizol方法提取RNA，并进行反转录得到cDNA，最后用PCR方法检测IKIP在mRNA水平的表达变化。
　　 同样的方法取出巨噬细胞后，用LPS，PGN刺激相应的时间点，然后收取蛋白，用western-blot的方法检测IKIP蛋白水平的表达变化。
　　 2、检测IKIP对促炎细胞因子的作用。
　　 2.1、转染IKIP的siRNA后，western-blot方法检测IKIP siRNA的干扰效率
　　 将IKIP的干扰RNA(siRNA)及阴性对照干扰RNA(snRNA)转染入人胚胎肾细胞系HEK293(Human Embryonic Kidney HEK293，HEK293)，静置培养24h，再转入Flag-IKIP表达载体，24h后收取蛋白，用BCA方法调整浓度一致，western-blot检测IKIP蛋白水平的变化。
　　 2.2、转染IKIP siRNA后，LPS、PGN刺激巨噬细胞，检测促炎性细胞因子的表达变化
　　 验证IKIP相应的siRNA干扰效率后，选取高干扰效率的siRNA，将其转染入腹腔巨噬细胞，48h后，用LPS刺激巨噬细胞相应时间点，提取RNA，进行反转录，利用PCR技术分析炎性细胞因子IL-6，TNF-α以及Ⅰ型干扰素mRNA水平上的表达变化。
　　 将Flag-IKIP表达载体转染Hela细胞系，24小时后用LPS刺激相应时间点，RT-PCR方法检测促炎细胞因子IL-6，TNF-α和Ⅰ型干扰素的表达变化。将Flag-IKIP表达载体转染HEK293-TLR2细胞系，4小时后用PGN刺激相应时间点，RT-PCR方法检测促炎细胞因子IL-6，TNF-α和Ⅰ型干扰素的表达变化。
　　 3、IKIP对TLRs信号通路中NF-κB活化调控的分子机制研究。
　　 3.1、转染Flag-IKIP表达载体和TLRs信号通路接头分子表达载体以及NF-κB，IFN-β报告基因质粒后，检测NF-κB，IFN-β报告基因活性的变化情况
　　 首先将Flag-IKIP表达载体和TLRs信号通路不同的接头分子的表达载体以及NF-κ B，IFN-β报告基因质粒共同转入HEK293细胞，24小时后，收取细胞，用双荧光素酶报告基因的方法检测IKIP对NF-κB报告基因活性的影响以及对IFN-β报告基因活性的影响，分析IKIP影响NF-κB活性的可能靶点。
　　 3.2、干扰IKIP后，Western-blot检测NF-κB及相关内源性蛋白分子的磷酸化情况
　　 将验证好的siRNA转染巨噬细胞48h后，用LPS刺激巨噬细胞相应时间点，收取蛋白，调整浓度一致后，western blot方法检测NF-κB及相关内源性蛋白分子的磷酸化情况，进一步确定IKIP对NF-κB通路的影响。
　　 3.3、验证IKIP与IKKβ的结合
　　 将Flag-IKIP表达载体与HA-IKKβ表达载体共同转入Hela细胞系或HEK293-TLR2细胞系后，分别用LPS或者PGN刺激2h，收取蛋白，通过免疫共沉淀（Immunoprecipitation，IP）方法检测两个分子的结合情况。
　　 3.4、IKIP对IKK复合物形成的影响。
　　 首先将Flag-IKIP表达载体与HA-IKKβ，HA-IKKα，HA-IKKγ表达载体共同转入Hela细胞系24小时后，再用LPS刺激相应时间后，收取蛋白，通过免疫共沉淀的方法进一步明确IKIP与IKK复合物中IKKβ分子的结合情况。为进一步明确作用方式，通过剂量竞争实验，转染不同剂量的MYC-IKIP表达载体和相同剂量的HA-IKKβ，HA-IKKγ表达载体于Hela细胞，24小时后用LPS刺激相应时间点，收取蛋白，通过免疫共沉淀方法检测随着IKIP的剂量的增加，IKKβ与HA-IKKγ结合是否发生变化。
　　 研究结果:
　　 1、LPS、PGN刺激巨噬细胞后，IKIP的表达量随着刺激时间的增加发生明显上调。
　　 C57/B6小鼠腹腔注射淀粉(6％)，72小时后，取出诱导产生的的原代腹腔巨噬细胞(Macrophage)，经LPS，PGN刺激0、2、4、8、12、24h，Trizol方法提取RNA，并进行反转录得到cDNA，最后用PCR方法检测发现，IKIP mRNA的表达随着时间的增长而显著增加。
　　 同样的方法取出巨噬细胞后，用LPS，PGN刺激相应的时间点，然后收取蛋白，用western-blot的方法检测发现，随着刺激时间的增加，IKIP蛋白水平的表达也明显增加。结论:通过LPS、PGN刺激巨噬细胞，IKIP的表达明显上调
　　 2、IKIP抑制促炎细胞因子的产生
　　 2.1、IKIP siRNA的干扰效果的验证
　　 将IKIP相应的干扰RNA(siRNA)转染入HEK293细胞24h后，再转入Flag-IKIP载体，24h后收取蛋白，用BCA方法调整浓度后，western-blot检测IKIP蛋白。IKIPsiRNA可以显著抑制FLAG-IKIP的表达。
　　 2.2、IKIP抑制促炎细胞因子的分泌
　　 将验证好的siRNA转入原代腹腔巨噬细胞48小时后，再用LPS，PGN分别刺激4小时，8小时，收取细胞，提取RNA，进行反转录，后用PCR分析，发现与对照组相比，干扰IKIP后，促炎因子IL-6，TNF-α的表达明显上调。而IFN-β无明显的变化。
　　 把Flag-IKIP载体分别转入Hela和HEK293-TLR2细胞24小时后，LPS刺激Hela，PGN刺激HEK293-TLR2细胞，提取RNA，进行反转录，用PCR方法，与对照组相比，检测促炎性细胞因子IL-6，TNF-α的表达明显下调。而IFN-β的表达无明显的变化。
　　 3、IKIP抑制NF-κB活性。
　　 3.1、IKIP抑制NF-κB报告基因的活性
　　 将Flag-IKIP，TLRs信号通路不同的接头分子以及NF-κB报告质粒，IFN-β报告质粒共转染HEK293细胞后，24小时后，收取细胞，通过双荧光素酶报告基因的方法检测，与对照组相比，IKIP实验组可显著降低MyD88、IKK-β所诱导的NF-κB报告质粒的荧光素酶活性。对TRIF，MyD88所介导的IFN-β报告质粒的荧光素酶活性没有影响，进一步说明IKIP可NF-κB的活化。
　　 3.2、Western-blot检测IKIP对NF-κB相关的内源性蛋白的影响
　　 将验证好的siRNA转染巨噬细胞48h后，LPS分别刺激巨噬细胞30分钟，60分钟，收取蛋白，用BCA的方法调整蛋白浓度，western blot检测pIκB，pP65，IκBα，P65的变化，与对照组相比，发现干扰IKIP后，pIκB，pP65蛋白水平明显上调;I-κBα降解增加，进一步说明IKIP对NF-κB的活化起到抑制作用。
　　 4、IKIP通过抑制IKKγ结合IKKβ负向调控NF-κB活化
　　 4.1、IKIP结合IKKβ
　　 将Flag-IKIP与HA-IKKβ载体共同分别转入Hela细胞，HEK293-TLR2细胞24h后，再用LPS刺激2h，收取蛋白，免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation，IP)的方法，检测到Flag-IKIP与HA-IKKβ两个分子的结合。结果表明，LPS刺激后可以诱导IKIP结合IKKβ。
　　 4.2、IKIP通过与IKKγ竞争的方式结合IKKβ负向调控NF-κB活化
　　 将Flag-IKIP与HA-IKKβ，HA-IKKα，HA-IKKγ载体共同转入Hela细胞24小时后，再用LPS刺激2h，收取蛋白，通过免疫共沉淀的方法进一步检测到IKIP仅仅与IKK复合物中IKKβ结合，而不是与其复合物的结合。为进一步明确结合IKKβ，IKIP的作用方式，我们又采取剂量竞争实验，转染不同剂量的MYC-IKIP和相同剂量的HA-IKKβ，HA-IKKγ于Hela细胞，LPS刺激2小时后，收取蛋白，IP的方法检测到随着IKIP剂量的增加，与IKKβ结合的IKKγ的量减少，表明，IKIP通过与IKKγ竞争结合IKKβ，影响IKK复合物的活性，来发挥抑制作用的。
　　 结论:
　　 1、LPS、PGN可以诱导巨噬细胞中IKIP的表达量。
　　 2、IKIP抑制LPS、PGN诱导的促炎因子及Ⅰ型干扰素的产生。
　　 3、IKIP负向调节NF-κB信号通路。
　　 4、IKIP通过与IKKγ竞争结合IKKβ，影响IKK复合物的形成，负向调控NF-κB的活性，发挥抑制炎症过度反应的作用。
　　 创新点及意义:
　　 1、本研究首次证实了IKIP可以参与TLRs信号通路的调控，而且通过进一步实验阐明了这种抑制作用主要机制，即IKIP通过与IKKγ竞争结合IKKβ，影响IKK复合物的形成，进而负向调控NF-κB的活性。
　　 2、固有免疫中炎症反应受到精细的调控，炎症的过度活化必定会引起一些炎症性疾病和自身免疫性疾病，本研究为负性调控NF-κB炎症反应提供了新的实验证据，为炎症性疾病的研究、诊断和治疗提供了新的思路。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

固有免疫

Toll-like receptors(TLRs)

IKIP

IKIP在固有免疫中的作用

材料和方法

1 实验材料

2．引物

3．一般试剂

4．pFLAG-CMV-2-IKIP质粒的构建

5．实验细胞的培养以及传代

6 反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)

7．转染

8 Western Blot检测蛋白分子的表达

9．免疫共沉淀检测IKIP与IKKβ的结合

10．报告基因

11．统计学处理

结果

1．LPS，PGN刺激巨噬细胞后，IKIP的表达明显上调

2．IKIP抑制促炎细胞因子的产生

3．IKIP抑制NF-κB活性

4．IKIP与IKKγ竞争结合IKKβ

讨论

结论

附图

参考文献

致谢

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