1α,25-二羟维生素D3对BMP2基因表达的调控及其机制研究

摘要

研究背景：
　　 维生素D3是目前临床上治疗骨质疏松的常用药物，它在体内通过羟化生成活性代谢产物1，25(OH)2D3（1α，25-dihydroxyvitaminD3）而发挥生理作用。1，25(OH)2D3是一种具有多种生物效应的激素前体，其主要是通过与靶细胞内的维生素D受体(VitaminDreceptor，VDR)结合后调节各种基因的表达，从而发挥其生理效应。它具有促进肠道钙和磷的吸收，促进肾小管对钙、磷的重吸收的作用。它一方面可以协同甲状旁腺激素刺激骨组织脱钙，提高血钙、磷浓度;另一方面也可以抑制甲状旁腺激素的合成释放，从而抑制甲状旁腺激素的骨溶解作用，使骨丢失减少。但是目前关于1，25(OH)2D3对骨形成及成骨细胞作用的报道仍很不一致。部分研究认为1，25(OH)2D3可诱导成骨细胞的分化成熟，对骨组织的形成有直接的促进作用。而另外一些研究则认为1，25(OH)2D3对成骨细胞有明显的抑制作用，直接抑制骨形成。因此，1，25(OH)2D3对骨形成的作用及机制仍需要进一步的研究。
　　 骨形态发生蛋白（Bonemorphogeneticprotein，BMP）是一组分泌性的多功能蛋白质，除BMP1外均属于TGF-β（转化生长因子-β）超家族成员，在体内可以通过旁分泌和自分泌的形式诱导骨的形成，是目前公认最强的骨诱导因子。BMP2是其中研究和应用最广泛的成骨生长因子之一，它可以在体外诱导间充质干细胞向成骨细胞分化，体内诱导骨形成。BMP2在启动和调节骨形成中起着关键的作用，因此任何影响BMP2基因表达的因素都可能会影响骨形成。
　　 若能阐明1，25(OH)2D3与BMP2基因表达的关系，对进一步理解1，25(OH)2D3在骨形成中的作用会有很大的帮助，目前文献中尚未有此类报道。
　　 遗传性高钙尿(Genetichypercalciuricstone-forming，GHS)大鼠是研究特发性高钙尿(Idiopathichypercalciuria，IH)患者的理想动物模型，它们都表现为小肠的钙吸收增加，肾脏的尿钙重吸收减少，骨密度减低。既往的研究表明GHS大鼠中肠钙吸收的增加，尿钙重吸收的减少与组织中VDR水平的增加有很大的关系。但是GHS大鼠中骨密度减低的原因仍不是十分清楚。本研究旨在通过探寻GHS大鼠中VDR与BMP2的关系来分析这种动物模型中骨密度减低的可能原因，并进一步探讨1，25(OH)2D3对BMP2基因表达的调控及可能的机制，从而进一步分析1，25(OH)2D3在骨形成中的作用及机制。
　　 目的:
　　 1、研究GHS大鼠和正常SD大鼠相同组织中维生素D受体蛋白和BMP2mRNA的基础表达水平并进行比较，分析VDR和BMP2可能存在的联系。
　　 2、体外培养GHS大鼠和SD大鼠的骨髓基质干细胞，以及UMR-106细胞，研究1，25(OH)2D3对BMP2mRNA表达的影响。
　　 3、研究1，25(OH)2D3调控BMP2基因转录表达的作用机制。
　　 4、探讨DNA甲基化和组蛋白修饰在1，25(OH)2D3调控BMP2基因表达中的作用。
　　 方法:
　　 1、选取成年GHS大鼠和SD大鼠，断颈处死，无菌条件下取出股骨和胫骨，抽取骨髓，应用红细胞裂解法及直接贴壁法获取并体外培养骨髓基质干细胞，无菌条件下取出肾脏及小肠，置入液氮中快速冷冻。应用蛋白质印迹(Westernblot)法检测GHS和SD大鼠骨髓基质干细胞、肾脏和小肠中的维生素D受体蛋白的水平。应用实时定量聚合酶链反应(Quantitativereal-timepolymerasechainreaction，qRT-PCR)法检测GHS和SD大鼠骨髓基质干细胞、肾脏和小肠中的BMP2mRNA的表达。
　　 2、分别应用1，25(OH)2D3处理体外培养的GHS大鼠和SD大鼠的骨髓基质干细胞和UMR-106细胞，应用qRT-PCR法检测细胞中BMP2mRNA表达的变化。
　　 3、应用软件分析BMP2基因转录调控区内可能的VDR结合位点，根据分析结果的基因序列，利用引物设计软件PrimerPremier5.0辅助设计相应的扩增引物。
　　 4、应用染色质免疫沉淀技术(ChromatinImmuno-Precipitation，ChIP)检测VDR与BMP2转录调控区DNA的结合，应用方法3中获得的扩增引物对ChIP产物进行PCR扩增，扩增产物进行凝胶电泳分析。
　　 5、克隆方法4中获得的BMP2转录调控区内VDR结合位点的基因片段，构建含此基因片段的荧光素酶基因表达载体，通过荧光素酶报告基因检测系统分析此片段的转录活性。
　　 6、DNA甲基转移酶抑制剂5-aza-2’-deoxycytidine(DAC)单独或联合1，25(OH)2D3处理体外培养的骨髓基质干细胞和UMR-106细胞，应用qRT-PCR检测BMP2mRNA的表达变化。组蛋白去乙酰酶抑制剂trichostatinA(TSA)单独或联合1，25(OH)2D3处理细胞，应用qRT-PCR检测BMP2mRNA的表达变化。
　　 7、1，25(OH)2D3处理UMR-106细胞后提取基因组DNA，应用重亚硫酸盐焦磷酸测序法(Bisulfitepyrosequencing)检测BMP2基因转录调控区CpG位点的甲基化状态的改变。
　　 8、1，25(OH)2D3处理UMR-106细胞后，应用染色质免疫沉淀技术检测BMP2转录调控区H3K9甲基化、组蛋白H3乙酰化程度的改变。
　　 结果:
　　 1、GHS大鼠骨髓基质干细胞、肾脏和小肠中的维生素D受体蛋白的水平较正常SD大鼠明显增加，BMP2mRNA的表达较正常SD大鼠明显降低。
　　 2、以10-8mol/L的1，25(OH)2D3分别处理体外培养的SD大鼠和GHS大鼠骨髓基质干细胞6h、12h和24h，与空白对照组比较，BMP2mRNA的表达均明显降低。以10-8mol/L的1，25(OH)2D3分别处理培养的UMR-106细胞1h、6h、12h、24h和48h，与空白对照组比较，BMP2mRNA的表达均明显降低。以不同浓度的1，25(OH)2D3分别处理体外培养的GHS大鼠和SD大鼠的骨髓基质干细胞和UMR-106细胞24h，与空白对照组比较，BMP2mRNA的表达均明显降低。
　　 3、软件分析了包括BMP2基因及其侧翼序列在内的共计28，545bp的一段基因序列，共获得8个可能存在的VDR结合位点(RegionA-H)。
　　 4、以VDR抗体进行ChIP实验，将ChIP产物PCR扩增后，进行凝胶电泳分析显示VDR能结合BMP2转录调控区的RegionC片段。
　　 5、成功构建了pGL3-RegionC-promoter荧光素酶报告基因质粒，将其转染入UMR-106细胞，结果显示构建的pGL3-RegionC-promoter荧光素酶报告基因与空白对照的PGL3-promoter相比，表达活性显著降低。1，25(OH)2D3的处理，使报告基因的荧光素酶表达活性进一步显著降低。
　　 6、不同浓度(0.5，1，2umol/L)的DAC处理来源于GHS大鼠的骨髓基质干细胞及UMR-106细胞后，均显著上调BMP2mRNA的表达，仅有0.5umol/L的DAC上调来源于SD大鼠的骨髓基质干细胞中BMP2mRNA的表达。但是当与1，25(OH)2D3联合使用时，与单独1，25(OH)2D3处理组相比，较高浓度(1，2umol/L)的DAC均能显著上调三种细胞中BMP2mRNA的表达。
　　 7、不同浓度（20，100，500nmol/L）的TSA处理来源于SD大鼠的骨髓基质干细胞后，显著上调BMP2mRNA的表达，而仅有20nmol/L的TSA上调来源于GHS大鼠的骨髓基质干细胞中BMP2mRNA的表达。当与1，25(OH)2D3联合使用处理来源于SD和GHS大鼠的骨髓基质于细胞，以及UMR-106细胞时，与单独1，25(OH)2D3处理组相比，较高浓度(100，500nmol/L)的TSA均能显著上调BMP2mRNA的表达。
　　 8、1，25(OH)2D3处理后，重亚硫酸盐测序显示BMP2基因转录调控区RegionC区域的一个CpG位点完全甲基化，而对照组同一CpG位点仍呈去甲基化状态。
　　 9、染色质免疫沉淀技术检测显示1，25(OH)2D3处理UMR-106细胞后，提高了BMP2转录调控区RegionC区域H3K9甲基化的程度，显著降低了BMP2转录调控区RegionC区域组蛋白H3乙酰化的程度。
　　 结论:
　　 1、在GHS大鼠的相同组织中，与正常SD大鼠比较，VDR水平升高而BMP2mRNA的表达降低。
　　 2、在体外培养条件下，1，25(OH)2D3可明显抑制骨髓基质干细胞及类成骨细胞中BMP2mRNA的表达。
　　 3、1，25(OH)2D3可通过与VDR的复合，进一步结合BMP2转录调控区的RegionC区域，从而抑制BMP2基因的转录表达。
　　 4、DNA甲基化和组蛋白修饰协同参与1，25(OH)2D3调控BMP2基因的转录表达过程。

目录

声明

摘要

符号说明

第一部分 1,25(OH)2D3对BMP2基因表达的调控作用

1 前言

2 实验材料

3 实验方法

4 结果

5 讨论

6 结论

参考文献

第二部分 1,25(OH)2D3调控BMP2基因表达的作用机制

1 前言

2 实验材料

3 实验方法

4 实验结果

5 讨论

6 结论

参考文献

第三部分 DNA甲基化与组蛋白修饰在1,25(OH)2D3调控BMP2基因表达中的作用

1 前言

2 实验材料

3 实验方法

4 实验结果

5 讨论

6 结论

参考文献

致谢

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