胚胎干细胞在Lewis肺癌中的体内外抗肿瘤作用研究

摘要

肺癌是当今世界对人类健康和生命威胁最大的恶性肿瘤，尽管采取一系列综合治疗手段，肺癌患者的生存率依然没有得到明显提高，据统计，肺癌患者总的1年生存率低于30％，5年生存率低于16％。目前在临床上广泛采用的传统治疗方式如外科治疗、化疗和放疗等治疗效果不理想，即使近年来迅速发展的分子靶向治疗和个体化治疗等效果也不尽如人意，研究显示导致这种结果的主要原因是由于肺癌的远处转移和治疗后的局部复发，因此如果能发现一种既具有直接杀伤肿瘤作用，又能够提高患者机体免疫功能、消灭循环系统微转移和远处转移的治疗方法或药物，无疑是肺癌患者的福音，而这些特点恰恰是肿瘤免疫治疗的优点所在。
　　 从免疫学角度而言，肿瘤的发生发展是肿瘤与机体免疫系统之间相互作用的结果，机体的免疫系统是体内一个功能强大而复杂的调控和执行网络，正常情况下具有明确抗原性的肿瘤细胞能被免疫识别并清除，然而肿瘤细胞通过在功能和结构方面发生一系列变化，使其能够逃避机体免疫系统的监视和杀伤作用。例如，肿瘤细胞通过改变其表面抗原的表达，使其免疫原性减弱，从而导致机体无法对其产生特异性的免疫应答;肿瘤细胞表面MHC分子缺失、表达下调或变异，导致抗原呈递过程障碍，从而不能被细胞毒性淋巴T细胞(CTL)识别并进一步影响肿瘤细胞的体内清除;多数肿瘤细胞协同刺激分子表达异常，导致细胞免疫中缺乏协同作用的第二信号传递，从而逃避机体免疫系统的攻击;肿瘤负荷引起体内的树突状细胞(DC)功能缺陷，因而抗原呈递能力变差，无法正常激活初始T细胞造成肿瘤的免疫耐受等;并且多数肿瘤细胞在体内能分泌多种免疫抑制因子，如转化生长因子β(TGF-β)、白细胞介素10(interleukin-10，IL-10)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、唾液酸粘蛋白(sialomucin)和巨噬细胞迁移抑制因子(macrophagemigration inhibitory factor，MIF)等，抑制体内T细胞分化和分泌功能，破坏Th1/Th2细胞因子的平衡状态，从而有利于肿瘤细胞在体内的生长和增殖。在肿瘤免疫治疗的临床实践中人们发现，正是由于肿瘤细胞表面抗原分子表达的改变、肿瘤本身对机体的免疫抑制作用以及肿瘤细胞免疫逃逸的存在使其表面标记和抗原能够逃脱机体的免疫监视，因而难以引发有效的免疫应答。
　　 人们经多年的研究发现肿瘤细胞与胚胎干细胞在很多重要的生物学行为方面都有着非常惊人的相似性，例如两者均具有快速增殖和分化能力、侵袭能力，并且能够在一定程度上逃逸机体的免疫监视，都在细胞表面表达类似的细胞因子，细胞内或核内具有许多共同的分子信号转导通路，并且在基因和蛋白水平共有很多相似的表达产物，尤为重要的是两者共同具有区别于成熟体细胞的、类似的细胞表面标记/表面抗原。研究发现胚胎干细胞及其衍生细胞来源的抗原，能够在体内有效激活CD4+和CD8+的T淋巴细胞，并且有研究证实，胚胎干细胞表面的MHC-Ⅰ类分子和其他蛋白抗原可以在体内诱发T淋巴细胞介导的、细胞毒性淋巴细胞作为效应细胞的的免疫反应。
　　 我们认为这种机体由于接种胚胎干细胞后诱导产生的稳定而持久的免疫反应，因为表面抗原的类似，可以交叉作用于肿瘤细胞，从而使机体具备了有效的抗肿瘤免疫，这为肿瘤的免疫治疗打开了新的思路。尽管当时机制尚不明了，德国学者Sch(o)ne等曾研究指出，啮齿类动物经接种早期胚胎组织可以明显抑制移植性肿瘤的生长。此后，经过一系列研究人们发现这样的现象，接种早期胚胎组织不仅可以抑制动物体内移植性肿瘤的生长，还可以预防由于物理、化学等致癌因素导致的肿瘤发生，这种抗肿瘤免疫作用对肿瘤的发生和发展均具有明显的抑制作用。而且最近的研究显示，这种胚胎组织/胚胎干细胞诱导的抗肿瘤免疫效应具有广谱的抗肿瘤作用，可能对多种肿瘤均具有显著的抑制作用;并且，这种作用被证实并不是一种机体针对外来异物发生的“异物反应”，人们推测其可能是由多种效应细胞和细胞因子参与构成的针对胚胎干细胞表面抗原的特异性免疫应答。
　　 在另一方面，胚胎干细胞抗肿瘤作用的体外研究也取得了一系列令人惊喜的研究成果。例如，Raof和Postovit等的研究显示胚胎干细胞的生长微环境具有诱导肿瘤细胞重新编程和良性转化的作用，并且能够在一定程度上抑制体内局部肿瘤的发生和转移瘤的出现;Giuffrida等研究发现，胚胎干细胞在体外环境中能够分泌一些可溶性的抗肿瘤因子，具有抑制多种肿瘤细胞的生长的作用，并且能够阻滞肿瘤细胞的细胞周期;Lee等证实胚胎干细胞微环境能够改变肿瘤细胞的生长方式，诱导恶性肿瘤获得一定的良性表型，从而具有抗肿瘤作用;Kulesa等研究发现，胚胎神经嵴发育微环境能够使高转移黑色素瘤向正常表型转化，恶性程度降低并表现为其起源细胞的细胞学形状;最近的研究结果表明，胚胎干细胞能在体外环境中诱导分化成为具有激发机体抗肿瘤免疫作用的抗原呈递细胞-树突状细胞，或者分化成为具有直接杀伤肿瘤细胞作用的免疫效应细胞，例如自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)、单核细胞和粒细胞等。
　　 本课题在总结前人研究工作经验的基础上，从体外和体内两方面深入研究胚胎干细胞在Lewis肺癌中的抗肿瘤作用，并在整体、细胞和分子水平探索其抗肿瘤作用的具体作用机制:在体外研究中，通过建立胚胎干细胞-Lewis肺癌细胞体外非接触式Transwell共培养体系，更直观、更直接地观察和检测胚胎干细胞/胚胎干细胞微环境对肿瘤细胞的抑制作用，研究共培养条件下Lewis肺癌细胞的重要生物学行为改变，主要包括细胞周期、细胞凋亡和肿瘤细胞迁移、侵袭能力特别是其成瘤能力等重要生物学行为的变化;在体内研究中，通过构建Lewis肺癌小鼠动物模型并模拟肿瘤发生发展的不同阶段，分别研究胚胎干细胞在预防移植性肿瘤的发生及肿瘤进展中的治疗作用两方面的相关作用机制，并从整体水平、效应细胞、细胞因子和肿瘤组织局部病理变化等多个方面探索胚胎干细胞在体内诱导抗肿瘤免疫过程中可能的作用机制和途径，为肺癌的免疫治疗和胚胎干细胞抗肿瘤作用研究开辟新的研究领域，为肺癌的预防及治疗带来新的希望。
　　 第一部分胚胎干细胞抗Lewis肺癌作用的体外研究
　　 第一节胚胎干细胞对Lewis肺癌细胞体外增殖的抑制作用
　　 研究目的:
　　 研究胚胎干细胞在体外细胞共培养条件下对Lewis肺癌细胞的抑制作用，探索胚胎干细胞体外抗肿瘤作用机制。
　　 研究方法:
　　 通过建立C57/BL6小鼠胚胎干细胞-Lewis肺癌细胞体外Transwell非接触式共培养体系，研究共培养条件下Lewis肺癌细胞的重要生物学行为改变，主要包括细胞周期、细胞凋亡，肿瘤细胞侵袭和迁移能力以及细胞增殖水平的变化。
　　 结果:
　　 Lewis肺癌细胞在与胚胎干细胞经非接触式共培养后，与对照组相比，实验组Lewis肺癌细胞体外增殖受到显著抑制，大部分Lewis肺癌细胞周期被阻滞在G2/M期，凋亡的细胞数目明显增多，并且肿瘤细胞迁移和侵袭能力明显下降，结果具有显著的统计学意义(P＜0.05)。
　　 结论:
　　 胚胎干细胞具有显著的体外抗肿瘤作用，包括能够抑制肿瘤细胞增殖，阻滞肿瘤细胞周期、促进肿瘤细胞凋亡，并且明显改变肿瘤细胞的侵袭和迁移能力，在一定程度上抑制其恶性表型。
　　 第二节胚胎干细胞对Lewis肺癌细胞成瘤能力的影响
　　 研究目的:
　　 研究Lewis肺癌细胞在与胚胎干细胞在体外共培养后对其成瘤能力影响，并探讨这一过程中相关的作用机制。
　　 研究方法:
　　 通过建立C57/BL6小鼠Lewis肺癌动物模型，研究与胚胎干细胞共培养后Lewis肺癌细胞的体内成瘤能力的改变，主要检测实验组与对照组小鼠皮下移植性肿瘤体积和重量的变化，并通过TUNEL方法检测肿瘤组织内细胞肿瘤细胞凋亡情况。
　　 结果:
　　 经与胚胎干细胞共培养后，Lewis肺癌细胞的成瘤能力显著下降，主要表现在实验组小鼠皮下肿瘤体积的增大和重量的增加均受到显著的抑制，并且实验组小鼠肿瘤组织中细胞凋亡的程度明显增加，结果具有显著的统计学意义(P＜0.05)。
　　 结论:
　　 胚胎干细胞在体外共培养过程中能够明显抑制Lewis肺癌细胞的成瘤能力，显著抑制其在体内实体肿瘤的生长，并诱导细胞凋亡增加，成瘤能力作为典型的恶性表型受到抑制，这种作用可能与胚胎干细胞能够在体外抑制Lewis肺癌细胞群体中肿瘤干细胞的活性有关。
　　 第二部分胚胎干细胞抗Lewis肺癌作用的体内研究
　　 第一节胚胎干细胞对Lewis肺癌发生的预防作用研究
　　 研究目的:
　　 研究实验小鼠经接种胚胎干细胞后，诱导体内抗肿瘤免疫反应的发生机制，及其对肿瘤发生的预防作用。
　　 研究方法:
　　 将γ射线灭活的胚胎干细胞经皮下注射进入C57/BL6小鼠体内完成免疫接种，在重复接种3次后检测小鼠免疫指标水平，主要通过流式细胞术检测外周血淋巴细胞（CD3+、CD4+、CD8+T细胞和CD19+B细胞）数量及比例、ELISA检测血清细胞因子(IL-2、IL4和IFN-γ)水平，接种Lewis肺癌细胞后，监测小鼠肿瘤生长情况并绘制肿瘤生长曲线，待动物实验结束后，检测脾脏淋巴细胞增殖情况，剥离肿瘤组织、秤重并制作组织切片，IHC检测肿瘤组织内CTL淋巴细胞浸润程度，TUNEL检测肿瘤组织细胞凋亡情况。
　　 结果:
　　 与对照组相比，经胚胎干细胞免疫接种的实验组小鼠外周血CD3+/CD8+T淋巴细胞绝对值和比例明显升高、血清Th1型抗肿瘤细胞因子(IL-2和IFN-γ)水平显著升高，脾脏T淋巴细胞增殖显著，肿瘤发生率明显降低(P＜0.05);即使在有肿瘤生长的实验组小鼠，其实体肿瘤生长速度受到显著抑制，病理学显示其肿瘤组织CTL淋巴细胞浸润明显增加，肿瘤组织内部细胞凋亡具有显著性差异(P＜0.05)。
　　 结论:
　　 接种胚胎干细胞能诱导机体产生显著的抗肿瘤预防作用，小鼠体内抗肿瘤细胞免疫水平明显提高，能够有效地抑制小鼠移植性肿瘤的发生。
　　 第二节胚胎干细胞对Lewis肺癌进展的治疗作用研究
　　 研究目的:
　　 研究胚胎干细胞在小鼠肿瘤模型中诱导抗肿瘤免疫反应的发生机制，及其对肿瘤发展的治疗作用。
　　 研究方法:
　　 采用C57/BL6小鼠皮下接种Lewis肺癌细胞建立肿瘤动物模型，并利用接种时间的长短和皮下瘤块的生长情况模拟不同的肿瘤发展时期，将γ射线灭活的胚胎干细胞经皮下注射进入小鼠体内（共3次间隔7天）进行免疫治疗，通过流式细胞术检测小鼠外周血淋巴细胞数量和比例变化、ELISA检测血清细胞因子水平，监测皮下肿瘤生长情况并绘制肿瘤生长曲线，待动物实验结束后剥离肿瘤组织称重，通过IHC检测脾脏淋巴细胞增殖情况和肿瘤组织淋巴细胞浸润程度，TUNEL检测肿瘤细胞凋亡情况。
　　 结果:
　　 在肿瘤模型小鼠中接种胚胎干细胞能够刺激机体CD3+/CD8+T淋巴细胞增殖，血清Th1型抗肿瘤细胞因子（IL-2和IFN-γ）水平显著升高(P＜0.05)，荷瘤鼠的免疫抑制状态得到改善，实体肿瘤的生长得到显著抑制，病理学显示实验组小鼠脾脏T淋巴细胞增殖明显增多，肿瘤组织局部有更多CTL淋巴细胞浸润，肿瘤细胞凋亡程度具有显著性差异(P＜0.05)。
　　 结论:
　　 在小鼠肿瘤模型中接种胚胎干细胞能显著缓解机体的免疫抑制状态，诱导抗肿瘤免疫的产生，对实体肿瘤的生长和进展具有显著的抑制作用。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

第一部分 胚胎干细胞抗Lewis肺癌作用的体外研究

第一节 胚胎干细胞对Lewis肺癌细胞体外增殖的抑制作用

研究背景

材料与方法

结果

讨论

结论

图片和表格

参考文献

第二节 胚胎干细胞对Lewis肺癌细胞成瘤能力的影响

研究背景

材料和方法

结果

讨论

结论

图片与表格

参考文献

第二部分 胚胎干细胞抗Lewis肺癌作用的体内研究

第一节 胚胎干细胞对Lewis肺癌发生的预防作用研究

研究背景

材料和方法

结果

讨论

结论

图片与表格

参考文献

第二节 胚胎干细胞对Lewis肺癌进展的治疗作用研究

研究背景

材料和方法

结果

讨论

结论

图片与表格

参考文献

论文的主要创新点

致谢

攻读学位期间发表的学术论文目录

Papers in English