Myxococcus xanthus DK1622中NA+/H+逆向转运蛋白及其转录调控研究

摘要

作为主要的钠离子(Na+)外排系统，钠离子/质子逆向转运蛋白(Na+/H+antiporters，NHAs)也是细菌中对Na+胁迫适应性应答的主要系统。NHAs是一种次级钠泵系统，于1974年在大肠杆菌中首次报道，广泛分布于细菌、古细菌、真菌、植物、动物、哺乳动物乃至人类细胞内。NHAs位于细胞质膜上，是一种跨膜蛋白，它可以利用初级质子泵，如ATPase(F0F1)和呼吸链产生的跨膜质子电化学梯度为动力，向膜外转运Na+，同时将H+转运回膜内，从而维持胞内相对较低的Na+浓度。
　　 目前结构和功能研究最为深入的NHAs是大肠杆菌Ec-NhaA，也是大肠杆菌等肠道细菌针对Na+及Na+存在条件下碱性pH产生适应性应答的主要系统。NhaA蛋白家族存在于许多细菌和古细菌中，其主要特点是活性具有高度pH依赖性。Ec-nhaA基因的转录受其下游基因Ec-nhaR的调控，后者属于LysR蛋白家族。Ec-NhaR能与Ec-nhaA基因的上游DNA序列结合，从而抑制Ec-nhaA基因的转录。但当Na+存在时，与Na+结合的Ec-NhaR发生了蛋白构象的改变，影响了Ec-NhaR与两个关键位点G-60和G-92的结合，从而促进Ec-nhaA基因的转录。因此，Ec-NhaR既是Na+信号的感受器，又是Na+信号的传导器，从而高效地调控Ec-nhaA基因的表达。
　　 粘细菌(Myxobacteria)是一类革兰氏阴性滑动细菌，具有复杂的多细胞行为，如生长的细胞密度依赖性，群体捕食，子实体发育以及在不良环境中分化形成粘孢子。课题组前期在Myxococcus xanthus DK1622的基因组中发现了2个预测为Na+/H+ antiporter NhaA的基因MXAN_3898和MXAN_6055，它们的敲除导致突变株在Na+条件下的生长显著下降，提示其可能在该菌株的盐胁迫应答中发挥作用。本论文在此基础上，深入研究了MXAN_6055基因产物可能的NhaA活性，并且对其转录调控机制进行了初步探索。
　　 首先围绕上述基因构建了一系列突变体，通过对其在盐胁迫条件下的生长、运动、发育等性质的分析，证明了MXAN_6055基因确实在M.xanthus DK1622的盐胁迫应答生长中发挥作用。MXAN_6055敲除突变株YL1012在NaCl或LiCl胁迫下的生长显著降低，如在200 mM NaCl胁迫下的生长较野生株下降了51％;当将该基因再回补到YL1012中时，其生长缺陷得到了恢复，从而证实上述M.xanthus突变株在NaCl或LiCl胁迫下的生长缺陷是由MXAN6055基因引起的。但是，MXAN_6055基因的过表达并没有导致菌株耐盐生长的显著提高，暗示MXAN_6055基因在细胞内存在转录调控机制或者更高水平的调控机制。
　　 其次，利用大肠杆菌Na+/H+ antiporters缺陷菌株KNabc进一步鉴定了MXAN_6055基因产物的NhaA活性。将MXAN_6055基因异源表达到KNabc菌株中，可使其在碱性条件下(pH7.0-8.0)的Na+和Li+耐受能力从完全敏感分别提高到600mM和100mM。利用高压破碎法制备了上述菌株的反转膜泡(evertedmembrane vesicles，EM Vs)，并利用吖啶橙荧光淬灭-恢复实验检测了其Na+(Li+)逆转运活性。结果表明EMVs在pH7.0和8.0时均具有Na+转运活性，且在pH7.0时的转运活性高于pH8.0时。以上结果证明了MXAN_6055蛋白确实具有Na+(Li+)耐受性和NhaA活性。
　　 最后，对MXAN_6055基因的转录调控机制进行了研究。以E.coli中Ec-NhaA的转录调控因子NhaR为提问序列，通过同源性检索在M.xanthus DK1622基因组中检索到其可能的同源基因MXAN_0784，两者的氨基酸序列一致性为34％。通过突变体构建及性质分析表明，与野生菌株M.xanthusDK1622相比，MXAN_0784的敲除导致突变株Na+胁迫下生长能力的降低，而其过表达则导致相应条件下生长能力的提高;qRT-PCR的检测结果与突变体性质分析结果一致，即:MXAN_0784敲除突变株中MXAN_6055基因的转录水平下降，而其过表达突变株中MXAN_6055基因的表达水平显著提高，表明MXAN_0784基因对MXAN_6055基因的转录具有正调控作用。将MXAN_0784进行异源表达并纯化后，利用bandshift试验验证了其与MXAN_6055基因上游调控序列的特异性结合能力。以上结果证明了MXAN_0784作为MXAN_6055基因的正转录调控因子，调控了后者在粘球菌盐胁迫应答中的NhaA活性。

目录

声明

摘要

符号说明及缩写词

第一章 文献综述

1．1 Na+／H+逆向转运蛋白(Na+／H+ antiporters，NHAs)简介

1．1．1 细菌中的Na+输出系统及NHAs在细菌中的主要功能

1．1．2 Ec-NhaA的结构与其作用机制

1．1．3 Ec-NhaA的转录调控机制

1．2 反转膜(everted membrane vesicles，EMVs)技术简介

1．2．1 EMVs的制备原理

1．2．2 EMVs的荧光检测原理

1．3 本论文工作开展思路和研究内容

第二章 nhaA预测基因对M．xanthus DK1622盐胁迫条件下生长发育的影响

2．1 实验材料

2．1．1 菌株与质粒

2．1．2 培养基

2．1．3 实验试剂

2．1．4 仪器设备与耗材

2．2 实验方法

2．2．1 MXAN_3898和MXAN_6055敲除突变体YL1015和YL1012的构建

2．2．2 YL1012和YL1015的耐盐生长能力分析

2．2．3 MXAN_6055回补及过表达突变株YL1050和YL1052的构建及性质分析

2．2．4 nhaA缺失突变株YL1053的构建

2．3 实验结果与分析

2．3．1 YL1012和YL1015在Na+(Li+)胁迫下的生长能力分析

2．3．2 YL1050和YL1052的性质分析

2．3．3 nhaA缺失突变株YL1053的构建

2．4 本章小结

第三章 MXAN_6055蛋白NhaA活性的鉴定

3．1 实验材料

3．1．1 菌株和质粒

3．1．2 培养基

3．1．3 实验试剂

3．1．4 仪器设备与耗材

3．2 实验方法

3．2．1 MXAN_6055基因的生物信息学分析

3．2．2 MXAN_6055蛋白盐离子耐受性的鉴定

3．2．3 MXAN_6055蛋白Na+(Li+)转运活性的鉴定

3．3 实验结果与分析

3．3．1 MXAN_6055基因的生物信息学分析

3．3．2 MXAN_6055蛋白在本源菌中Na+(Li+)转运活性的鉴定

3．3．3 MXAN_6055蛋白Na+(Li+)耐受性的鉴定

3．3．3 E．coliKNabc：：MXAN_6055菌株中Na+(Li+)转运活性的鉴定

3．4 本章小结

第四章 Mx-nhaA(MXAN_6055)基因的转录调控

4．1 实验材料

4．1．1 菌株和质粒

4．1．2 培养基

4．1．3 实验试剂

4．1．4 仪器设备与耗材

4．2 实验方法

4．2．1 MXAN_0784基因的生物信息学分析

4．2．2 MXAN_0784过表达突变株YL1054的构建

4．2．3 各MXAN_0784突变株的耐盐生长能力分析

4．2．4 qRT-PCR实验验证MXAN_0784对Mx-nhaA(MXAN_6055)基因的转录调控作用

4．2．5 Band shift试验验证MXAN_0784蛋白的体外DNA结合能力

4．3 实验结果与分析

4．3．1 MXAN_0784基因的生物信息学分析

4．3．2 MXAN_0784过表达突变株YL1054的构建

4．3．3 各MXAN_0784突变株在Na+胁迫条件下的生长能力分析

4．3．4 qRT-PCR实验验证MXAN_0784对MXAN_6055基因的转录调控作用

4．3．5 Band shift试验验证MXAN_0784蛋白的体外DNA结合能力

4．4 本章小结

第五章 总结与展望

附录

参考文献

致谢