基于蛋白质组学研究氧化还原相关基因在前列腺癌耐药中的作用及调控机制

摘要

前列腺癌(prostate cancer,PCa)是男性常见的恶性肿瘤。随着人口老龄化、饮食结构、环境因素等改变，我国前列腺癌发病率，特别是晚期前列腺癌的发病率呈显著上升趋势。内分泌治疗是PCa的首选治疗方案，但大多数患者在治疗后一年左右复发，演变为激素难治性前列腺癌(Hormone-refractory prostate cancer,HRPC)，常伴有骨转移等，恶性程度高。目前以多烯紫杉醇为基础的化疗是治疗HRPC的一线方案，能适当提高患者的生存率。然而，化疗后产生的毒副作用、多药耐药等问题同样严重制约其治疗效果。多烯紫杉醇作为广谱抗肿瘤药物，其耐药机制已有研究:如多烯紫杉醇的作用靶点α-或β-微管蛋白高表达或作用位点突变;药物外排蛋白P-glycoprotein(P-gp)、MRP1等高表达导致多烯紫杉醇在细胞内的浓度减少;抗凋亡蛋白BCL2，XIAP，Survivin，以及Clusterin的高表达使药物诱导凋亡的作用下降。此外，以炎症因子如Interleukin(IL)-1β，IL6，和肿瘤坏死因子TNF-α等也参与细胞多药耐药、侵袭转移等。然而，前列腺癌多药耐药细胞有其特殊之处，如P-gp不表达，IL6表达升高等。同时，单靶点药物如用反义核酸抑BCL2或着用抗体封闭IL6并没有取得理想的治疗疗效。因此，寻找与耐药表型相关的关键分子/信号将对阐明前列腺癌耐药机制、治疗靶点具有重要意义。
　　课题组前期研究发现，通过多烯紫杉醇诱导的前列腺癌多药耐药细胞，微管蛋白有所增加，炎症因子IL6上调显著，但P-gp无表达。为确定其耐药机制，本研究利用蛋白质组学的方法，通过对激素非依赖PCa多药耐药细胞、敏感细胞进行蛋白表达差异分析，确定了10个差异蛋白。通过初步的功能分析，发现耐药细胞中超氧化物岐化酶(superoxide dismutase 2，SOD2)高表达而且实验数据显示耐药细胞与敏感细胞相比处于还原状态。受氧化还原状态调控的蛋白如insulin-like growth factor 1 receptor(IGF-1R)、(B-cellCLL/lymphoma 2)BCL2等表达升高。进一步分析证实，SOD2通过降低ROS而下调β-Aresstin1（ARRB1）的蛋白表达，导致由ARRB1介导的IGF-1R降解受阻，进而增加IGF-1R的蛋白水平。另外，耐药细胞高表达的炎症因子IL6通过上调STAT3增加IGF-1R的mRNA水平，同时IL6也可上调SOD2的表达。因此，细胞的氧化还原状态（低水平的ROS）和炎症因子（高表达的IL6）可分别从蛋白水平和转录水平上调IGF-1R的表达，高表达的IGF-1R通过上调BCL2和药泵蛋白Multidrug resistance associated protein 2(MRP2)介导细胞的药物耐受。
　　第一部分:蛋白质组学筛选鉴定SOD2为前列腺癌细胞多烯紫杉醇耐药相关蛋白
　　一、前列腺癌多药耐药株的构建
　　前列腺癌PC3细胞为激素非依赖细胞株，抗凋亡能力较强、恶性程度高。我们以PC3细胞为模型、以多烯紫杉醇(Docetaxel，Doc)为诱导药物，通过浓度递增法诱导筛选耐药细胞株，得到能够在含终浓度为20nM多烯紫杉醇的培养基里稳定生长的耐药细胞株PC3/Doc。
　　PC3/Doc对多烯紫杉醇的半数致死浓度(IC50)提高38倍，并对拓扑异构酶靶向药物多柔比星产生交叉耐药性，其耐药倍数为8倍，对DNA损伤药物顺铂的交叉耐药性较弱（耐药倍数为2倍），表明PC3/Doc具有多药耐药特性。
　　二、蛋白质组学研究PC3细胞与耐药PC3/Doc的差异蛋白及功能分析
　　1、荧光差异双向电泳-质谱技术分析PC3细胞与其耐药细胞PC3/Doc的蛋白表达差异谱:通过对48个差异点分析，确定出10种差异表达蛋白，其中表达上调的5种蛋白为:超氧化物岐化酶2(SOD2)、热休克蛋白90β1(HSP90B1)、细胞增殖核抗原(PCNA)、蛋白二硫键异构酶A3（PDIA3）、细胞色素b-c1复合物亚基1(QCR1);表达下调的蛋白有:周质素3(PLIN3)、Ras特异性GTP结合蛋白（RANG）、Ⅱ型角蛋白(K2C7)、核苷二磷酸激酶A(NDKA)、波形蛋白(VIME)。
　　2、差异蛋白的表达验证:我们通过蛋白免疫印迹技术对蛋白质组学筛选得到的部分差异蛋白进行表达水平的验证，结果表明SOD2、HSP90B1、PCNA、PDIA3在耐药细胞中高表达，NDKA、VIME在耐药细胞中低表达，与组学结果一致。另外，我们前期的Microarray数据表明，耐药细胞中SOD2、HSP90、PDIA3在转录水平也同样高表达
　　3、差异蛋白在耐药细胞的功能分析:根据现有实验条件，采用RNAi方法降低耐药细胞中三种高表达的蛋白SOD2、HSP90B1、PDIA3，并分析表达下调后细胞对药物的敏感性，结果显示，下调SOD2表达可显著增加细胞对药物的敏感性。而在敏感细胞PC3中高表达SOD2，可显著增加细胞对药物的耐受。鉴于SOD2的表达和作用，我们确定SOD2可能在前列腺癌耐药过程中具有重要作用，并进一步分析其参与耐药的作用机制。
　　第二部分:SOD2通过调控IGF-1R表达参与前列腺癌细胞的多烯紫杉醇耐药
　　一、耐药细胞SOD2等抗氧化酶对细胞氧化还原状态的影响
　　1、耐药细胞ROS水平降低:流式分析结果显示，与敏感株PC3细胞相比，耐药PC3/Doc细胞中ROS水平显著降低，还原型GSH与氧化型谷胱甘肽GSSG的比率上升，表明耐药细胞处于低氧状态。
　　2、SOD2参与ROS水平的调节:流式分析结果显示，降低耐药细胞SOD2的表达会增加耐药细胞的ROS水平，表明SOD2的高表达参与降低耐药细胞氧化水平。定量PCR结果和Microarray数据表明，其它抗氧化酶或蛋白，如过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)、谷胱甘肽硫转移酶(GSTP1)、硫氧还蛋白(TXN)在耐药细胞中显著上调，而超氧歧化酶1(SOD1)、硫氧还蛋白过氧化物酶3(PRDX3)、nuclear factor erythroid 2-like 2(NFE2L2)略有升高。以上结果表明，耐药细胞中ROS水平的降低是一系列抗氧化酶共同作用的结果，SOD2参与其中。
　　二、SOD2正调控IGF-1R的蛋白表达，但对其转录水平没有影响
　　1、氧化还原状态调控基因表达:利用Microarray数据分析26多个受氧化还原状态调控基因的变化，结合定量PCR验证，发现IGF-1R、CXCR4、BCL2在耐药细胞中表达显著上调。蛋白印迹实验进一步确定IGF-1R和BCL2在耐药细胞中高表达。
　　2、SOD2上调IGF-1R的蛋白表达:在耐药PC3/Doc细胞中，通过siRNA靶向降低SOD2水平，IGF-1R蛋白水平降低，其mRNA水平并没有变化。在PC3细胞中，过表达SOD2能明显上调IGF-1R蛋白水平，但对IGF-1R的转录没有明显影响。
　　三、SOD2通过抑制IGF-1R的降解而稳定其蛋白水平
　　1、耐药细胞中IGF-1R的稳定性增加:由于耐药细胞中IGF-1R的蛋白水平显著上调，我们首先分析其蛋白的稳定性。IGF-1R的泛素化降解途径通常是由ARRB1和MDM2或者NEDD4和GRB10介导的。定量PCR结果显示，NEDD4和GRB10的表达在敏感细胞和耐药细胞中并无显著差异，但ARRB1在耐药细胞中的表达显著降低、MDM2显著上调。蛋白免疫印迹结果显示，耐药细胞ARRB1的蛋白水平也明显降低。ARRB1作为衔接蛋白将MDM2(E3)募集到IGF-1R，对IGF-1R降解至关重要。在PC3细胞中干扰下调ARRB1后，IGF-1R表达显著恢复，表明PCa细胞中ARRB1介导IGF-1R的降解。
　　2、在耐药细胞中敲低SOD2上调ARRB1的表达，同时IGF-1R表达下调;在敏感细胞中过表达SOD2下调ARRB1的表达，同时上调IGF-1R的表达。
　　3、SOD2介导的低水平ROS降低ARRB1的表达:在SOD2低表达、ROS水平相对较高的PC3细胞中加入抗氧化剂维生素C(VC)处理后，ARRB1的蛋白水平随着作用时间的延长而逐渐减少，IGF-1R的多泛素化程度降低;而SOD2高表达、ROS水平较低的耐药细胞经H2O2刺激后，显著增加ARRB1的蛋白水平和IGF-1R蛋白的多泛素化。
　　4、ARRB1的转录调控:通过软件预测和基因芯片相结合的方法，预测ARRB1启动子中含有转录因子FOXP1、FOXA1和YY1的结合位点，而这些转录因子在芯片数据中表达降低。荧光色素酶活性分析结果显示，我们利用构建的质粒，共转染ARRB1启动子和FOXP1的表达质粒在PC3、PC3/Doc细胞中都能增强ARRB1启动子的活性，表明FOXP1可促进ARRB1的转录活性。
　　5、动物实验验证ROS水平影响IGF-1R蛋白稳定性:将ROS水平较高的PC3细胞裸鼠成瘤后，尾静脉注射VC溶液。结果显示，VC处理组的小鼠瘤重和瘤体积都有所增加，而且细胞增殖markerKi67阳性率增加。免疫组化和蛋白印迹实验结果表明，VC显著下调ARRB1的蛋白表达、增加IGF-1R的表达水平，与细胞实验一致。
　　四、炎症因子IL6刺激IGF-1R的转录表达同时通过SOD2和ARRB1抑制IGF-1R的降解
　　1、耐药细胞中IL6高表达:Microarray数据提示我们耐药细胞中IL6的表达显著增高，ELISA结果进一步证实，与PC3细胞相比，IL6在耐药细胞PC3/doc中表达显著上调。
　　2、IL6通过SOD2调控IGF-1R:在耐药细胞中，封闭IL6、抑制IL6信号可降低SOD2的表达，而ARRB1蛋白表达增加、IGF-1R蛋白表达上调。
　　3、IL6通过STAT3在转录水平增加IGF-1R的表达:实时定量PCR结果显示，在耐药细胞中封闭IL6信号下调IGF-1R的mRNA表达。蛋白印迹结果显示，耐药细胞中STAT3、phospho-STAT3表达均显著上调，而抑制IL6信号后导致STAT3、IGF-1R的表达均显著下调，表明IL6可调节STAT3的表达。定量PCR结果显示，通过siRNA下调STAT3的表达，可显著降低IGF-1R的mRNA水平，为了进一步确定STAT3在转录水平上调IGF-1R的表达，我们在PC3细胞中共表达STAT3表达载体和IGF-1R的启动子，双荧光报告基因检测结果显示，过表达STAT3显著增强IGF-1R启动子活性。
　　第三部分:IGF-1R参与前列腺癌细胞多烯紫杉醇耐药的机制研究
　　一、耐药细胞中高表达的IGF-1R激活其介导的信号通路参与细胞耐药
　　1、耐药细胞IGF-1R信号持续活化:Microarray芯片数据显示，与PC3细胞相比，耐药细胞PC3/Doc细胞中IGF-1R的配体如IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ都无变化。然而，耐药细胞中高表达的IGF-1R呈持续活化状态，磷酸化的IGF-1R(Tyr980/1131/1135/1136)的表达均升高，并使下游靶基因如phosphor-Akt，phosphor-Shc的活化。
　　2、IGF-1R参与细胞耐药:在耐药细胞中，我们利用RNAi下调IGF-1R，MTT结果显示，细胞对多烯紫杉醇的敏感度明显增加。
　　二、IGF-1R通过下游信号通路调控BCL2和MRP2参与细胞耐药
　　1、BCL2和MRP2在耐药细胞中高表达:有文献报道耐药相关基因MRP2和BCL2受IGF-1R调控，蛋白免疫印迹实验表明MRP2和BCL2在PC3/Doc细胞中高表达。
　　2、IGF-1R通过信号通路调控MRP2和BCL2的表达:目前IGF-1R行使功能通过两种方式:一是通过下游信号通路，二是从细胞膜移位至细胞核，起转录因子或辅助因子的作用。免疫荧光和蛋白免疫印迹结果显示，IGF-1R在耐药细胞中并无明显入核。我们将IGF-1R蛋白中1025、1100、1120三个位点赖氨酸突变突变为精氨酸，导致该位点不能进行Sumo化修饰而无法入核，得到的突变型表达载体pcDNA3.1-IGF-1R-M。在PC3细胞中，分别转染pcDNA3.1-IGF-1R-WT（野生型）和pcDNA3.1-IGF-1R-M，IGF-1R表达显著上调，MRP2和BCL2表达也上调。但野生型IGF-1R和突变型的IGF-1R对MRP2和BCL2的表达无明显差别，这表明，IGF-1R调控MRP2和BCL2不是通过入核起作用的，而是通过下游信号通路来实现的。
　　3、其它耐药相关蛋白的作用:P-gp或MRP2和CYP蛋白被认为是多烯紫杉醇药物代谢的关键分子。MRP2受IGF-1R调控，CYP蛋白是否受IGF-1R调控还没有报道。芯片数据和定量PCR结果显示，CYP3A4、CYP3A5、CYP3A7和CYP3A43在耐药细胞中的表达均有不同程度地上升。然而，敲低IGF-1R的表达对CYPs的表达并无显著影响，表明CYPs可能参与前列腺癌的多药耐药，但可能不是通过IGF-1R信号发挥作用。
　　第四部分:结论及创新点
　　一、结论
　　1、通过DIGE/MOF/MS蛋白质组学分析发现SOD2在前列腺癌多药耐药细胞中高表达，并且参与多烯紫杉醇耐药。
　　2、SOD2通过下调ROS、降低IGF-1R降解关键蛋白β-arrestin1（ARRB1）表达，从而抑制IGF-1R降解，导致耐药细胞中IGF-1R高表达，但SOD2对IGF-1R的mRNA水平无明显影响。
　　3、耐药细胞中高表达的IL6通过调控STAT3、在转录水平促进IGF-1R的表达;同时，IL6通过正调控SOD2，后者通过降低ROS下调ARRB1的表达，进而增加IGF-1R蛋白的稳定性。
　　4、IGF-1R在耐药细胞中高表达并持续活化，通过上调BCL2和MRP2参与细胞的抗凋亡及药物耐受多药耐药。
　　二、创新点与不足之处
　　1.首次报道SOD2在前列腺癌细胞耐药细胞中高表达，并参与其耐药:SOD2能够通过调控ROS和ARRB1增加IGF-1R蛋白稳定性、降低其蛋白降解而发挥作用。但SOD2介导的细胞耐药是否还存在其它机制尚需进一步探讨。
　　2.首次报道IL6可通过转录因子STAT3在转录上调IGF-1R的表达。同时，IL6也可上调SOD2的表达，后者通过ROS显著增加IGF-1R的蛋白水平。但其它转录因子对IGF-1R表达的影响、以及IL6如何调控SOD2的还需进一步研究。
　　3.首次报道ARRB1在前列腺癌耐药细胞中低表达，并负调控前列腺癌细胞多药耐药;首次发现ROS正调控ARRB1表达，而IL6负调控ARRB1的表达。但ROS、IL6对ARRB1表达调控机制、以及低水平的ARRB1如何参与耐药过程尚需研究。