饥饿状态对白色念珠菌生物膜滞留菌的影响及滞留菌相关基因的单细胞分析

摘要

目的：
　　作为人类最常见的条件致病菌——白色念珠菌（Candidaalbicans），所引起的感染性疾病大都是慢性和难治性的，这与其形成的生物膜结构密切相关。白色念珠菌生物膜高耐药性的可能机制有:生物膜基质对药物的空间位阻和屏障作用;生物膜中白色念珠菌的特殊生长状态，例如迟缓生长状态;基因水平的耐药机制;生物被膜内细胞质膜脂质成分的影响;以及近几年提出的‘滞留菌’的产生等等。越来越多的研究提示，正是滞留菌(Persisters)的存在，使得药物无法完全清除白色念珠菌生物膜，对慢性迁延性感染的产生起到了关键性的作用。
　　已有研究证实了细菌滞留菌的产生机制主要包括以下2个方面:微生物群体中生长速度的异质性，极少数生长处于静止状态的菌细胞亚群成为滞留菌;饥饿等环境因素导致的SOS反应，即极端不利环境因素诱导。这表明滞留菌的产生机制，并非单一的由生长状态异质性造成的，而是与环境因素的诱导也有密切关系。那么，改变生物膜代谢的营养环境，是不是也会对白色念珠菌耐药滞留菌的产生有一定的影响呢？
　　本实验即通过研究饥饿环境对白色念珠菌生物膜以及其耐药滞留菌形成的影响，证实白色念珠菌生物膜耐药滞留菌形成的第二种机制（环境因素影响机制）;并且，进一步运用基于Taqman探针的单细胞real-timeRT-PCR技术相对定量检测滞留菌相关基因，为今后白色念珠菌耐药滞留菌相关基因的研究提供方便、可行的研究技术。
　　材料和方法：
　　(1)饥饿状态对白色念珠菌生物膜及其耐药滞留菌形成的影响
　　体外分别构建对数期、稳定期和饥饿状态白色念珠菌生物膜模型，两性霉素B(AmB)冲击作用24h，冲击前后均进行活菌菌落计数(CFU)，计算得出滞留菌比例并进行统计学分析，同时通过共聚焦显微镜观察和分析各组生物膜的形成状况。
　　(2)基于Taqman探针的单细胞real-timeRT-PCR技术相对定量检测滞留菌相关基因的表达水平
　　倒置显微镜下，使用自行拉制的分离微吸管吸取非滞留菌细胞和滞留菌细胞，进行基于Taqman探针的单细胞real-timeRT-PCR，相对定量检测白色念珠菌生物膜耐药滞留菌EFG1、ERG2、MKC1、GIN4基因的表达水平，采用SPSS11.70软件包对数据进行统计学分析。
　　结果：
　　(1)对数期、稳定期和饥饿状态白色念珠菌生物膜的形成能力依次下降(P＜0.05)，具有显著性差异，对数期和稳定期白色念珠菌生物膜形成的为菌丝相生物膜，而饥饿态白色念珠菌形成的为酵母相生物膜。药物作用后滞留菌比例依次上升(P＜0.05)。
　　(2)基于Taqman探针的单细胞real-timeRT-PCR技术相对定量地检测出了白色念珠菌滞留菌中EFG1、ERG2、MKC1、GIN4的表达水平。其中，除了MKC1在滞留菌细胞和非滞留菌细胞中的表达水平无显著性差异(P＞0.05)外，EFG1、ERG2、GIN4在滞留菌中的表达水平明显升高(P＜0.05），具有显著性差异。
　　结论：
　　(1)营养状态对白色念珠菌滞留菌的产生有影响，饥饿状态能够提高滞留菌的产生比例，提示白色念珠菌耐药滞留菌形成与营养状态等环境因素有关。
　　(2)自制的分离微吸管能够成功分离出滞留菌细胞，在此基础上，基于Taqman探针的单细胞real-timeRT-PCR技术是快速检测滞留菌相关基因表达水平的有效方法，为今后研究白色念珠菌滞留菌相关基因提供了方便、可行的研究技术。
　　(3)白色念珠菌滞留菌的形成与基因EFG1、ERG2以及GIN4均密切相关，并非由单一的信号通路决定的，受多条信号途径的调节。

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摘要

英语缩略词表

前言

第一部分 饥饿状态对白色念珠菌生物膜及其耐药滞留菌形成的影响

材料和方法

结果

讨论

第二部分 基于Taqman探针的单细胞real-time RT-PCR相对定量检测滞留菌EFG1、ERG2、MKC1、GIN4的表达水平

材料和方法

实验结果

讨论

参考文献

致谢

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