IGF-1调控β-catenin信号参与糖尿病角膜上皮细胞创伤愈合的机理

摘要

第一部分:IGF-1在高糖培养的角膜上皮细胞创伤愈合中的作用研究
　　目的:
　　研究高糖培养的人永生化角膜上皮细胞(Humantelomerase-immortalizedcornealepithelialcells，THCE)及糖尿病大鼠角膜上皮中，高糖对创伤刺激的IGF-1及IGF-1R表达的影响，探讨外源性IGF-1对高糖培养的THCE细胞增殖、迁移、凋亡的影响及相关分子机制，阐明IGF-1在高糖培养的角膜上皮细胞创伤愈合中的作用。
　　方法:
　　1.根据文献报道的THCE高糖干预模型，分别用5mM-45mM浓度的葡萄糖处理THCE细胞24h或48h，MTT法检测THCE细胞存活率，筛选合适的高糖浓度及作用时间。根据文献报道的外源性IGF-1干预浓度，分别用10-200ng/ml的IGF-1处理THCE细胞48h，MTT法检测THCE细胞存活率，筛选合适的IGF-1浓度。
　　2.分别用5mM、25mM浓度的葡萄糖预处理THCE细胞48h，经生长因子饥饿12h后，收集未划伤及划伤后不同时间点的两组细胞及细胞培养上清，利用real-timePCR法检测IGF-1及IGF-1RmRNA表达，酶联免疫吸附试验(ELISA)测定IGF-1蛋白水平，westernblot分析IGF-1R蛋白表达，免疫荧光细胞化学法检测IGF-1、IGF-1R蛋白分布及表达。
　　3.比较正常及糖尿病大鼠角膜上皮创伤愈合情况，研究创伤后角膜上皮中IGF-1、IGF-1RmRNA及蛋白的表达。
　　4.高糖预处理THCE细胞且生长因子饥饿后，外源性添加IGF-1(50ng/ml)。于刺激后不同时间点分别对5mM葡萄糖、25mM葡萄糖、25mM葡萄糖+IGF-1处理的三组细胞，利用MTT法检测细胞增殖能力;细胞划痕实验检测细胞迁移能力;AnnexinV-FITC/PI双荧光染色法+流式细胞仪检测细胞凋亡。
　　5.高糖预处理THCE细胞且生长因子饥饿后，外源性添加IGF-1(50ng/ml)。于刺激后不同时间点分别收集5mM葡萄糖、25mM葡萄糖、25mM葡萄糖+IGF-1处理的三组细胞，利用real-timePCR法、westernblot及免疫荧光细胞化学法检测增殖、迁移及凋亡相关因子ki-67、MMP-2、bax、bcl-2mRNA及蛋白的表达。
　　结果:
　　1.制作高糖干预模型的合适条件为25rmM浓度的葡萄糖处理THCE细胞48h。外源性添加IGF-1的合适浓度为50ng/ml。
　　2.在正常或高糖培养的两组THCE细胞中，划伤可刺激IGF-1及IGF-1RmRNA表达上调;划伤后12及24h，高糖组IGF-1及IGF-1RmRNA表达显著低于正常组;划伤后24及48h，高糖组IGF-1及IGF-1R蛋白表达显著低于正常组;划伤后48h，高糖组IGF-1及IGF-1R荧光染色强度低于正常组。
　　3.与正常大鼠相比，糖尿病大鼠角膜上皮刨伤愈合显著延迟。伤后1，2，3天，糖尿病大鼠角膜上皮中IGF-1、IGF-1RmRNA表达显著低于正常大鼠。伤后2，3天，糖尿病大鼠角膜上皮中IGF-1、IGF-1R荧光染色强度低于正常大鼠。
　　4.高糖抑制THCE细胞存活率，下调增殖相关因子ki-67mRNA及蛋白表达。高糖+IGF-1组的细胞存活率、ki-67mRNA及蛋白表达显著高于高糖组，与正常组无显著差异。
　　5.高糖抑制THCE细胞迁移能力，下调迁移相关因子MMP-2mRNA及蛋白表达。高糖+IGF-1组的细胞迁移能力、MMP-2mRNA及蛋白表达显著高于高糖组，与正常组无显著差异。
　　6.高糖诱导THCE细胞凋亡，上调促凋亡因子baxmRNA及蛋白表达，下调凋亡抑制因子bcl-2mRNA及蛋白表达。添加IGF-1可改善高糖诱导的细胞凋亡及bax、bcl-2表达变化，但与正常组相比，仍存在显著差异。
　　结论:
　　在THCE细胞及糖尿病大鼠角膜上皮中，高糖抑制创伤刺激的IGF-1及IGF-1R表达。高糖通过抑制IGF-1表达，引起ki-67、MMP-2、bcl-2表达下调、bax表达上调，从而降低THCE细胞增殖、迁移，诱导THCE细胞凋亡，这可能是导致角膜上皮细胞创伤愈合延迟的原因之一。
　　第二部分:β-catenin信号在高糖培养的角膜上皮细胞创伤愈合中的作用研究
　　目的:
　　研究高糖培养的THCE划伤后β-catenin信号的表达，探讨激活β-catenin信号对高糖培养的THCE细胞增殖、迁移、凋亡的影响及相关分子机制，阐明β-catenin信号在高糖培养的角膜上皮细胞创伤愈合中的作用。
　　方法:
　　1.高糖预处理THCE细胞且生长因子饥饿后，外源性添加β-catenin信号激活剂Licl(0.5mM)。对5mM葡萄糖、25mM葡萄糖、25mM葡萄糖+Licl处理的三组细胞，进行划伤刺激，于不同时间点利用real-timePCR法检测β-catenin、cyclinD1、c-mycmRNA表达，westernblot分析β-catenin、cyclinD1、c-Myc蛋白表达。
　　2.高糖预处理THCE细胞且生长因子饥饿后，外源性添加0.5mMLicl。于刺激后不同时间点分别对5mM葡萄糖、25mM葡萄糖、25mM葡萄糖+Licl处理的三组细胞，利用MTT法检测细胞增殖能力;细胞划痕实验检测细胞迁移能力;AnnexinV-FITC/PI双荧光染色法+流式细胞仪检测细胞凋亡。
　　3.高糖预处理THCE细胞且生长因子饥饿后，外源性添加0.5mMLicl。于刺激后不同时间点分别收集5mM葡萄糖、25mM葡萄糖、25mM葡萄糖+Licl处理的三组细胞，利用real-timePCR法、westernblot及免疫荧光细胞化学法检测增殖、迁移及凋亡相关因子ki-67、MMP-2、bax、bcl-2mRNA及蛋白的表达。
　　结果:
　　1.高糖抑制β-catenin、cyclinD1、c-MycmRNA及蛋白表达，外源性添加Licl可上调β-catenin、cyclinD1、c-MycmRNA及蛋白表达，激活β-catenin信号。
　　2.高糖抑制THCE细胞存活率，下调增殖相关因子ki-67mRNA及蛋白表达。高糖+Licl组的细胞存活率、ki-67mRNA及蛋白表达显著高于高糖组，与正常组无显著差异。
　　3.高糖抑制THCE细胞迁移能力，下调迁移相关因子MMP-2mRNA及蛋白表达。高糖+Licl组的细胞迁移能力、MMP-2mRNA及蛋白表达显著高于高糖组，但与正常组相比，仍存在差异。
　　4.高糖诱导THCE细胞凋亡，上调促凋亡因子baxmRNA及蛋白表达，下调凋亡抑制因子bcl-2mRNA及蛋白表达。添加Licl可改善高糖诱导的细胞凋亡及bax、bcl-2表达变化，但与正常组相比，存在显著差异。
　　结论:
　　在THCE细胞中，高糖通过抑制β-catenin及下游靶基因cyclinD1、c-Myc的表达，引起ki-67、MMP-2、bcl-2表达下调、bax表达上调，从而降低THCE细胞增殖、迁移，诱导THCE细胞凋亡，这可能是导致角膜上皮细胞创伤愈合延迟的原因之一。
　　第三部分:IGF-1调控β-eatenin信号参与高糖培养的角膜上皮细胞创伤愈合的研究
　　目的:
　　研究高糖培养的THCE划伤后，外源性IGF-1对β-catenin信号表达的影响，明确IGF-1是否通过调控β-catenin信号共同参与高糖损害的角膜上皮细胞创伤愈合。
　　方法:
　　高糖预处理THCE细胞且生长因子饥饿后，外源性添加IGF-1。对5mM葡萄糖、25mM葡萄糖、25mM葡萄糖+IGF-1处理的三组细胞，进行划伤刺激，于不同时间点利用real-timePCR法检测β-catenin、cyclinD1mRNA表达，westernblot分析β-catenin、cyclinD1蛋白表达。
　　结果:
　　高糖抑制β-catenin、cyclinD1mRNA及蛋白表达，外源性添加IGF-1可显著上调高糖抑制的β-catenin、cyclinD1mRNA及蛋白表达。
　　结论:
　　IGF-1可调控β-catenin信号共同参与糖尿病角膜上皮创伤愈合。