花生中胁迫抗性microRNA的挖掘鉴定和功能分析

摘要

MicroRNA，又称miRNA，是一类广泛存在于动物、植物、病毒等多种生物体内、大小为21-25nt左右的内源性非编码单链小分子RNA[1]。MicroRNAs以碱基互补对的方式对靶基因进行翻译抑制或降解，在多细胞生物的基因表达调控过程中发挥着重要的作用。对miRNA的鉴定和功能分析已经成为了研究的热点并在过去的十年研究中取得了巨大成果。
　　花生是世界四大油料作物之一，同时也是世界范围内广泛栽培的一类十分重要的经济作物。花生作为我国主要的油料作物、经济作物和出口创汇作物，其分子生物学遗传育种研究一直受到广泛的重视，目前鲜见花生内源性miRNA的功能与抗性相结合的研究。
　　本论文利用生物信息学预测，通过设置筛选的条件，新发现60条保守花生miRNA序列。根据植物miRNAs序列在物种间的高度保守性及其前体独特的二级结构特征，通过在miRNAs数据库中进行同源性比较，最终将60条miRNA序列归属分类于16个家族中。然后，利用Target-align软件和BLASTx分析对60花生miRNAs进行靶基因预测，除2条miRNA序列未发现靶基因外，其他58条miRNA序列共计预测获得392条靶基因序列，经过对靶基因的GO功能分析发现，miRNA的靶基因介导参与花生生长发育，信号转导以及胁迫抗性等多个生物学过程和功能。
　　生物信息学方法预测miRNAs具有方便、快速和经济的优点，但是在预测过程中会存在假阳性序列，需要通过进一步的实验验证，来完善和验证预测。通过poly(A)加尾实验方法，经过对反应条件的不断优化，最终16个家族的60条miRNAs中55条miRNA序列得到实验验证，成功率高达为91.67％。miR159家族，miR319家族，miR394家族中各有1条miRNA序列未被检出，miR482家族中有两条miRNA序列未被检出。
　　miRNA靶基因的确认工作是研究miRNA功能中最关键的一步。植物miRNA序列通常以一种完美互补或近乎完美互补的匹配方式切割靶基因，进而造成靶基因序列的降解。基于这一点本研究使用5'-RACE的方法对预测的花生靶基因切割位点进行实验验证，确定生物信息学预测的准确性。本实验随即选择20条花生靶基因序列作为验证对象，通过凝胶电泳检测实验和克隆测序结果可知，其中14条(70％)花生miRNA-靶基因获得验证，大部分miRNAs作用于靶基因的切割位点位于第9-11个核苷酸位点处，并且部分靶基因存在多个切割位点的情况。
　　本研究对靶基因序列进行功能分析和同源序列功能检索，初步选择26条靶基因序列作为胁迫研究对象，并在黄曲霉侵染和干旱胁迫条件下，利用实时定量PCR技术测定相关抗性miRNA及其靶基因的表达水平。针对miRNA负调控靶基因表达水平模式进行研究，结果表明，共有5组miRNA靶基因符合要求，初步确定部分与胁迫抗性相关的miRNA及其靶基因的生物学功能。
　　通过生物信息学与实验技术相结合的手段，完成花生中与胁迫抗性相关的miRNAs的挖掘，预测其靶基因并筛选鉴定miRNAs的功能。通过增强或削弱内源性miRNA的基因沉默效应，从而改变花生中与胁迫抗性相关的靶基因表达状况，为提高花生抗逆能力奠定理论基础。