人脑脊液中神经递质水平与相关疾病关系的研究

摘要

目的:
　　神经递质对于哺乳动物神经系统的功能起着重要的介导作用，也参与维系脑部血液的循环。病理情况下神经递质与脑血管病、颅脑外伤密切相关，甚至影响脑的继发性病变。脑脊液中神经递质的测定对于了解神经递质在中枢系统的作用和对中枢系统疾病的诊断及发病机理的研究都具有重要意义。本文在一些已有的研究的基础上，对方法进行改进，建立了一种采用NBD-F对氨基酸样品进行柱前衍生，应用高效液相色谱仪荧光检测器(HPLC-FLD)进行检测的方法，利用这种方法对病毒性脑炎患者、化脓性脑炎患者、脑瘤患者、蛛网膜下腔出血患者和急性淋巴细胞白血病患者脑脊液中的天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、牛磺酸(Tau)、甘氨酸(Gly)和γ-氨基丁酸(GABA)5种氨基酸类神经递质进行测定，并参照文献记载方法测定上述患者脑脊液中的去甲肾上腺素(NE)、肾上腺素(E)、多巴胺(DA)和5-羟色胺(5-HT)4种单胺类神经递质，探讨脑脊液中神经递质的水平与疾病的关系，为疾病的诊断和鉴别诊断提供理论依据。
　　方法:
　　1.脑脊液中氨基酸类神经递质的测定方法
　　1.1样品处理
　　样品离心沉淀蛋白后准确量取100μL上清液于1.5mL离心管中，依次加入200μL乙腈，175μLpH9.5硼酸缓冲液，密封混匀后加入25μL0.1mol/LNBD-F使用液，混匀，于60℃水浴中避光反应7min后取出，冷却至室温，采用高效液相色谱-荧光检测法(HPLC-FLD)检测。
　　1.2色谱条件
　　色谱柱:SHIMADZUshim-packVP-ODS250×4.6mm，5μm;柱温30℃;流动相:乙腈-磷酸缓冲盐溶液(0.02mol/L，pH6.0;16∶84，v/v);流速1.0mL/min;激发波长475nm，发射波长536nm;进样量10μL。
　　2.脑脊液中单胺类神经递质的测定方法
　　2.1样品处理
　　样品离心沉淀蛋白后取上清，采用高效液相色谱-荧光检测法(HPLC-FLD)检测。
　　2.2色谱条件
　　色谱柱:SHIMADZUshim-packVP-ODS250×4.6mm，5μm;柱温30℃;流动相:甲醇-醋酸钠溶液(0.1mol/L，醋酸调pH2.5-3;2∶98，v/v);流速1.2mL/min;荧光激发波长280nm，发射波长314nm;进样量10μL。
　　结果:
　　1.脑脊液中氨基酸类神经递质的测定结果
　　1.1氨基酸类神经递质测定的方法学研究
　　在给定的条件下，脑脊液中5种氨基酸类神经递质在15min内分离完全且分离良好，5种氨基酸类神经递质在0.1～100μmol/L范围内，线性关系良好(r＞0.999)。
　　Asp:Y=25918X+3517(r=0.9998)，最低检出浓度为2.34×10-3μmol/L，加标回收率为98.3％、102.2％和96.6％，日内精密度RSD为2.7％、3.6％和4.2％，日间精密度RSD为4.8％、4.6％和3.9％。
　　Glu:Y=17397X+1952(r=0.9999)，最低检出浓度为1.78×10-3μmol/L，加标回收率为98.2％、94.7％和102.7％，日内精密度RSD为3.8％、2.9％和4.4％，日间精密度RSD为5.6％、4.2％和3.7％。
　　Gly:Y=28913X+2074(r=0.9997)，最低检出浓度为8.33×10-3μmol/L，加标回收率为99.4％、105.2％和102.7％，日内精密度RSD为4.2％、3.4％和4.6％，日间精密度RSD为5.2％、4.8％和5.1％。
　　Tau:Y=36726X+6736(r=0.9995)，最低检出浓度为5.75×10-3μmol/L，加标回收率为96.3％、98.6％和104.5％，日内精密度RSD为3.4％、2.9％和4.1％，日间精密度RSD为4.7％、5.6％和5.2％。
　　GABA:Y=19475X+3638(r=0.9998)，最低检出浓度为7.26×10-3μmol/L，加标回收率为106.1％、97.3％和99.6％，日内精密度RSD为3.1％、3.6％和4.7％，日间精密度RSD为4.2％、6.0％和4.3％。
　　1.2脑脊液中氨基酸类神经递质与疾病的关系
　　病毒性脑炎患者脑脊液中Glu、Gly、Tau的含量显著高于对照组(P＜0.05)，化脓性脑炎患者脑脊液中Asp、Glu、Gly、Tau的含量显著高于对照组(P＜0.05)，低。
　　蛛网膜下腔出血患者脑脊液中Asp、Glu、Gly、Tau、GABA的含量均明显高于对照组(P＜0.05)。
　　脑瘤患者脑脊液中Asp、Gly的含量明显低于对照组(P＜0.05)。
　　急性淋巴细胞白血病患者脑脊液中Glu、Gly的含量显著高于对照组(P＜0.05)。
　　2.脑脊液中单胺类神经递质的测定结果
　　1.1单胺类神经递质测定的方法学研究
　　在给定的条件下，脑脊液中4种单胺类神经递质在20min内分离完全且分离良好，4种单胺类神经递质在0.02～10μmol/L范围内，线性关系良好(r＞0.999)。NE:Y=77573X+5638(r=0.9997)，最低检出浓度为3.67×10-4μmol/L，加标回收率为97.8％、98.2％和103.6％，日内精密度RSD为3.2％、2.6％和4.3％，日间精密度RSD为4.7％、4.9％和3.8％。
　　E:Y=173671X+7663(r=0.9999)，最低检出浓度为2.16×10-4μmol/L，加标回收率为104.2％、99.8％和98.6％，日内精密度RSD为4.1％、3.9％和3.4％，日间精密度RSD为4.5％、5.2％和3.7％。
　　DA:Y=55632X+2241(r=0.9997)，最低检出浓度为7.87×10-4μmol/L，加标回收率为103.4％、97.2％和102.5％，日内精密度RSD为4.5％、3.1％和4.2％，日间精密度RSD为5.0％、4.6％和4.8％。
　　5-HT:Y=98126X+5633(r=0.9996)，最低检出浓度为4.29×10-4μmol/L，加标回收率为99.1％、105.6％和97.4％，日内精密度RSD为3.8％、4.9％和4.7％，日间精密度RSD为5.6％、4.5％和5.3％。
　　1.2脑脊液中单胺类神经递质与疾病的关系
　　病毒性脑炎患者脑脊液中5-HT的含量显著低于对照组(P＜0.05)，化脓性脑炎患者脑脊液中5-HT的含量显著高于对照组(P＜0.05)。
　　蛛网膜下腔出血患者脑脊液中NE含量均明显高于对照组（P＜0.05），5-HT的含量显著低于对照组（P＜0.05）。
　　脑瘤患者脑脊液中NE含量均明显低于对照组(P＜0.05)，5-HT的含量显著高于对照组(P＜0.05)。
　　结论
　　1.NBD-F对氨基酸样品进行柱前衍生，高效液相色谱仪荧光检测器(HPLC-FLD)进行检测的方法分离效果好，灵敏度高，准确度好，结果可靠，适合脑脊液中氨基酸类神经递质的的测定。
　　2.检测脑炎患者脑脊液中的氨基酸有助于脑炎的诊断，利用氨基酸和5-HT在脑脊液中的不同改变对则鉴别病毒性脑炎及化脓性脑炎具有一定的意义。
　　3.检测分析蛛网膜下腔出血患者脑脊液中兴奋性氨基酸神经递质和单胺类神经递质可为疾病的早期诊断及治疗提供相应的参考依据。
　　4.研究脑瘤患者脑脊液中氨基酸和单胺类神经递质水平的变化有助于探讨癌细胞的代谢，可为脑瘤的治疗提供一定的线索。
　　5.检测急性淋巴细胞白血病患者脑脊液中的氨基酸水平可以为白血病患者氨基酸疗法提供可靠的依据。