l-半胱氨酸/硫化氢信号途径对空肠上皮营养物质吸收的调节

摘要

目的：
　　硫化氢是一种已知的由胃肠道产生的具有细胞毒性的气体，其在体内由胱硫醚β合成酶(CBS)和胱硫醚γ裂解酶(CSE)催化L-半胱氨酸而产生。内生性的硫化氢被报道在人类和小鼠的胃肠道其浓度在0.2-3.4mmol/L。硫化氢刺激肠上皮的钾离子通道，引起钾离子的外流从而造成细胞的超极化状态，但是它对于营养物质吸收的影响尚不可知。我们已经知道，营养物质的吸收除了与转运载体有关以外，同时还与细胞膜两侧的电化学梯度密切相关，我们试图弄清硫化氢信号在肠上皮营养物质的吸收中是否起作用。因此本研究的目的是观察L-半胱氨酸/硫化氢信号途径是否在空肠上皮表达，尤其是参与营养物质吸收的上皮细胞上的表达情况;探讨L-半胱氨酸/硫化氢信号系统在空肠上皮表达的生理意义。
　　方法：
　　组织准备和短路电流测量
　　大鼠脱臼处死，空肠约被剪成1.5cm的片段，沿纵轴剪开，用冰克氏液冲洗。浆膜和肌层被撕去，留下粘膜及粘膜下层。准备好的组织被安装在两个尤斯半室的中间，两侧各5ml，37℃的克氏液浸浴，向其中通95％O2和5％CO2的混合气体（组织暴露面积为0.5cm2）。组织被一个具有校正溶液电阻的程控电压钳装置短路(VCC MC4; Physiologic Instruments，San Diego，Calif)。通过给予一个电流脉冲，组织的两侧电势差被始终钳制为零。基线值被确定为给药之前约3分钟的平均电参数值，在给药之前，组织在河豚毒(10umol/L)存在的情况下约孵育30分钟以达到稳定的短路电流。
　　硫化氢的生成
　　大鼠空肠（粘膜及粘膜下层，0.1g）加入到50mmol/L的冰磷酸盐缓冲液(PH=6.8)0.5ml中匀浆，然后将其置于一个容积约20ml的反应瓶的外槽，一小片浸有醋酸锌(1％，0.5ml)的滤纸(0.5×1.5cm)放入反应瓶的内槽。在加入L-半胱氨酸（终浓度10mmol/L）和5-磷酸吡哆醛(终浓度2mmol/L)之前，向瓶中缓慢充入氮气约20秒。然后盖上密封盖37℃水浴90分钟。之后三氯乙酸被加入反应瓶以终止反应，继续水浴60分钟后，硫化氢被醋酸锌捕获形成硫化锌。随后滤纸及醋酸锌溶液被移入已经装有N，N-二甲基-对苯二胺盐酸盐(20 mmol/L;0.5mL)和三氯化铁(30 mmol/L;0.4mL)的试管中，混匀后静置20分钟，在670nm处读取分光光度值(Spectra Max190，Molecular Devices，USA)。用已知浓度的硫氢化钠来绘制标准曲线。
　　口服葡萄糖耐量试验
　　30只6-8周的雄性C57小鼠被随机分成5组。在禁食9个小时（第一天晚上11:00pm到第二天8:00am，自由饮水）后取2ul的尾端末梢血用手持血糖仪（ACCU-CHEK，罗氏，德国）测空腹血糖。用葡萄糖溶液灌胃（1g/kg），随即各组分别在腹腔内注射:生理盐水(0.1ml/10g);硫氢化钠（5mg/kg）;L-半胱氨酸(100mg/kg);AOA(50mg/kg)+PAG(100mg/kg);L-半胱氨酸（100mg/kg）+AOA（50mg/kg）+PAG(100mg/kg)。半小时后，分别从门静脉和尾端取40ul和2ul的血液测餐后血糖。
　　蛋白质印迹法
　　取0.1 gWistar大鼠和C57小鼠的空肠（粘膜和粘膜下层）在1ml的冰裂解液中匀浆。匀浆液4℃，12000转/分钟，20分钟离心取上清。上清液进行蛋白标准定量后用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，分离的蛋白质被转移到聚偏二氟乙烯膜上，然后用5％脱脂奶粉（用含有0.2％Tween-20的TBS溶解）室温封闭2小时。随后一抗4℃封闭过夜，（CBS∶sc-67154，rabbit polyclonal IgG, Santa CruzBiotechnology;final dilution1∶500;CSE∶ab131052,rabbit polyclonal antibody tocystathionase，Abcam;final dilution1∶500)。TBST洗后，二抗常温孵育1小时，目的蛋白用化学发光方法显影。
　　免疫组化实验
　　组织多聚甲醛固定后石蜡包埋切片（厚度6um）。65℃烤片1小时后依次浸入二甲苯，100％，90％，80％，70％乙醇脱蜡和水化。PBS洗3次后，用抗原修复液微波修复（0.482g柠檬酸钠，0.075g柠檬酸，200ml水，高火3分钟，低火30分钟）。PBS洗3次后，3％过氧化氢避光孵育10分钟消除内源性过氧化物酶。PBS洗后，一抗4℃孵育过夜，作为阴性对照，不加一抗孵育。PBS洗3次后，A液孵育30分钟（100ul，基因科技，兔鼠通用型免疫组化试剂盒）。镜下控制DAB显色时间。
　　统计
　　数据用均数±标准误(Mean±SEM)的方式给出，n代表样本数。在比较两组数据时，配对和非配对T检验视具体情况被运用;在比较多组数据时，用one-wayANOVA进行数据分析，P＜0.05被视为具有统计学意义。
　　实验结果：
　　1，Western Blot结果显示在大鼠或小鼠的空肠上皮表达CBS和CSE。
　　2，免疫组化结果显示CBS主要表达于空肠绒毛尖端的吸收细胞和隐窝细胞，而CSE则主要表达于隐窝细胞。
　　3，硫化氢生成实验结果显示组织匀浆液能有效地将L-半胱氨酸转换为硫化氢，证实了CBS和CSE两种酶类的活性。
　　4，Ussing Chamber实验结果显示外生性的硫化氢(NaHS)以及L-半胱氨酸能浓度依赖地引起空肠上皮细胞短路电流(Isc)的降低，而这种现象能被钾离子通道阻断剂格列苯脲部分阻断。浆膜侧给予L-半胱氨酸能增加L-丙氨酸和葡萄糖所引起的短路电流，L-半胱氨酸的这种效应能被CBS抑制剂，氨基氧乙酸(AOA)所抑制，却并不能被CSE抑制剂L-炔丙基甘氨酸(PAG)所抑制。外生性的硫化氢供体，GYY4137而非硫氢化钠也能显著增加L-丙氨酸所引起的效应。
　　5，口服葡萄糖耐量试验(OGTT)用药理学或基因学的方法引起硫化氢信号通路的异常，能导致餐后30分钟的血糖异常以及体重的异常。
　　结论：
　　1，CBS，CSE两种酶类在小鼠和大鼠的空肠上皮功能性表达
　　2，L-半胱氨酸/硫化氢信号途径增加空肠上皮营养物质的吸收，这种效应可能是通过激活空肠上皮的K+通道而实现的

目录

声明

摘要

英文缩略词和中文对照

前言

材料与方法

1．实验动物

2．实验器材和材料

3．实验试剂

4．实验方法

结果

1，在小肠上皮细胞上存在着H2S合成的途径

2，外源性和内源性的H2S浓度依赖性地引起大鼠空肠上皮短路电流的降低

3，H2S的供体L-半胱氨酸或GYY4137增加大鼠空肠上皮L-丙氨酸、葡萄糖的转运

4，H2S信号系统受损能导致异常的餐后血糖以及体重减轻

讨论

CBS是空肠上皮细胞H2S的主要来源酶

H2S这种气体递质的功能效应依赖于它释放的速度和／或局部达到的浓度

H2S增加大鼠空肠上皮对L-丙氨酸和葡萄糖的吸收

小肠上皮营养素的吸收受主要由CBS来源的H2S的调节

H2S在营养素吸收中的生理学和病理生理学意义

结论

附图

文献综述 硫化氢对消化系统的调节作用及其机制

参考文献

致谢

攻读硕士期间发表的科研成果