脑神康胶囊对高糖乏氧环境下大鼠海马神经元氧化应激损伤的保护作用

摘要

目的:
　　研究高糖乏氧环境下体外培养的大鼠海马神经元8-OHdG、HIF-1α、ROS、VEGF因子的表达并探讨脑神康胶囊对神经元的保护作用。
　　方法:
　　1.制备含中药血清选择24只成年雄性Wistar大鼠，用随机数字表法随机分为正常对照组（0.9％氯化钠）、脑神康低剂量组(5ml/kg)、中剂量组(10ml/kg)、高剂量组(20ml/kg)，等量灌胃给药;每天2次，连续3天，末次给药1h后，无菌条件下右心房取血，制备含药血清，-20℃保存备用。
　　2.海马神经元原代培养出生24h之内的Wistar大鼠，在75％酒精中浸泡消毒，断头，取出完整脑组织，无菌条件下分离出双侧海马，剪碎，消化，过滤，离心重悬后，接种，培养于37℃、5％CO2的培养箱，并于接种后第4～6h换以含2％B27的DMEM/F12培养基，以后每2天半量换液，倒置相差显微镜观察细胞形态。
　　3.大鼠海马神经元鉴定MAP-2（microtubule-associated protein-2，微管相关蛋白）荧光染色检测细胞爬片后第9天，经过洗涤，固定，正常山羊血清、一抗及二抗孵育，缓冲甘油封固后，在荧光显微镜下观察神经元MAP-2表达阳性细胞，并进行显微摄影。
　　4.制备高糖乏氧损伤模型原代细胞培养8天后，分组及处理如下：
　　(1)高糖乏氧组:加入终浓度为1 mmol/L的X和20U/L的XO产氧体系，作用45min后换无血清高糖培养基培养，12h后测指标;
　　(2)脑神康低、中、高剂量组则分别将脑神康低、中、高剂量的含药血清加入培养液中作用30min，后加入X/XO体系，作用45min后换无血清高糖培养基培养，12h后测指标;
　　(3)正常对照组:常规换液培养，12h后测指标。
　　5.酶联免疫定量吸附实验法(Elisa)检测8-OHdG、ROS、HIF-1α蛋白浓度，Real-time PCR法检测各组海马神经元HIF-1αmRNA、ROS mRNA、VEGFmRNA的表达。
　　结果:
　　1.MAP-2鉴定海马神经元结果显示:体外培养的细胞为大鼠海马神经元，阳性细胞率为85～90％。在倒置相差显微镜下观察，高糖乏氧组（X/XO组）的神经元细胞数量减少，胞体肿胀;脑神康高剂量组的神经元细胞形态损伤减轻，生长状态良好。
　　2.酶联免疫定量吸附实验法(Elisa)检测结果显示:与正常对照组比较，8-OHdG、ROS、HIF-1α产生明显增多（P均＜0.01）;与高糖乏氧组比较，脑神康各浓度组8-OHdG、ROS、HIF-1α产生明显降低（P均＜0.01），以高剂量组降低最明显。
　　3.Real-time PCR法检测结果显示:与正常对照组比较，HIF-1α mRNA、ROSmRNA和VEGF mRNA的表达显著上升（P均＜0.01）;与高糖乏氧组比较，脑神康各浓度组HIF-1α mRNA、ROS mRNA和VEGF mRNA的表达明显下降(P均＜0.05)，以高剂量组下降最明显。
　　结论:
　　脑神康可保护高糖乏氧环境下大鼠海马神经元，其机制可能与下调8-OHdG、ROS、HIF-1αmRNA、ROS mRNA和VEGFmRNA的表达，减轻氧化应激损伤有关。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

材料与方法

1、材料

二、方法

3、数据处理

结果

1、大鼠海马神经元镜下观察

2、大鼠海马神经元MAP-2免疫荧光染色鉴定结果

3、酶联免疫定量吸附实验法(Elisa)检测8-OHdG、ROS、HIF-1α蛋白浓度结果

4、Real-time PCR法检测各组海马神经元HIF-1α mRNA、ROS mRNA、VEGF mRNA的表达结果

讨论

1 糖尿病脑病(DE)

2．海马神经元与DE

3．海马神经元的提取及体外原代培养

4、中医对DE的认识

5、脑神康胶囊

6、局限与展望

结论

附图

附表

参考文献

致谢

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