宏基因组法检测侵袭性牙周炎治疗前后菌斑微生物多样性

摘要

目的:口腔是人体与外界相通的环境，是微生物进入人体消化道、呼吸道的门户，口腔中定植着复杂的微生物群落，是人体各种微生物群落最复杂的环境之一。通常在健康人的口腔中有700多种细菌、真菌及病毒等微生物，它们与宿主的龋病及牙周病等口腔疾病密切相关。正常情况下在口腔环境中寄居的各种微生物之间存在着错综复杂的共栖方式，并保持着菌群微生物之间的相对平衡，同时保持着菌群微生物与宿主之间的动态平衡，这种平恒对于保持口腔的健康非常重要。这种平衡通常不是一成不变的，口腔内菌群微生物的种类与数量随人的年龄、饮食、口腔卫生状况、口腔局部及全身情况等变动，这种平衡是相对的、可变的和有条件的，当口腔内菌群微生物之间、微生物与宿主之间达到动态的平衡时，就能保持宿主的口腔健康。反之，当口腔内菌群微生物之间的平衡被打破，口腔内菌群微生物失去制约，或菌群微生物与宿主之间平衡被打破，都会引起宿主的口腔疾病，甚至影响全身健康。
　　近年来，宏基因组与人类健康和和疾病的关系越来越受到关注。身体不同部位的微生物和功能性宏基因组应当作为人体生物系统的一部分的观点逐渐得到认同。身体不同部位的宏基因组之间的区别揭示了宏基因组影响组织和器官功能的机制。不同的微生物组成及其功能与身体的健康或疾病状态紧密联系在一起。因此对人体组织器官中的宏基因组进行更多的细节研究将会为多种疾病的诊断和治疗提供帮助。
　　本研究用宏基因组学的方法对侵袭性牙周炎治疗前后的微生物构成进行比较分析，从微生物群落水平揭示侵袭性牙周炎患者治疗前后龈下菌斑的组成与多样性，解析龈下菌斑微生物群落的变化与侵袭性牙周炎之间的相互关系。
　　方法:对符合纳入标准两例侵袭性牙周炎患者(G、Z)详细询问并记录病史，对患者进行口腔检查、牙周检查、拍摄曲面断层片，记录探诊出血(bleeding on probing，BOP)和探诊深度(probing depth，PD)。给予患者牙周基础治疗，包括洁治、刮治和根面平整。分别在基线水平及牙周基础治疗1月后进行临床牙周检查和龈下菌斑取样。在上下颌第一磨牙近中颊面的牙周袋部位棉球隔湿，去除龈上菌斑，吹干，用灭菌刮器在牙周袋底采取龈下菌斑样品，取得牙菌斑置于盛有0.5mmPBS的EP管中，3000r/min离心5min，弃上清液，将盛有沉淀的EP管储存于-80℃冰箱中备用。提取样品总DNA，经过PCR扩增，对16S rDNA的V4高变区进行测序，对侵袭性牙周炎龈下菌斑菌群组成与结构进行分析。
　　结果:1、患者G、Z经牙周基础治疗1月后，临床症状和牙周指数(BOP、PD)都得到改善。
　　2、患者G、Z牙周基础治疗前后龈下菌斑16份样品DNA扩增出特异性DNA产物用于测序分析，16份样品均可注释到属水平，经Illumina Miseq测序平台共获得原始序列952272条，经过拼接质控、过滤低质量和短长度及过滤嵌合体后的有效序列915626条，通过与文库比对分析，能够分类的序列887803条。
　　3、患者G、Z牙周基础治疗前后龈下菌斑内菌种种类、数目均有明显改变。其中放线菌门、变形菌门在牙周治疗后在龈下菌斑微生物菌群中所占比例显著增多，而拟杆菌门、螺旋体门、互养菌门在牙周基础治疗后在龈下菌斑微生物菌群中所占比例明显减少。牙周基础治疗前后龈下菌斑菌种及多样性差别大，治疗前菌种多样性及菌群结构复杂性比治疗后要高;治疗前不同个体侵袭性牙周炎龈下菌斑菌群结构相似，经牙周基础治疗，侵袭性牙周炎得到控制后，不同个体间的龈下菌斑结构差异较大。
　　结论:综上所述，本研究通过宏基因组高通量测序的方法对两名广泛型侵袭性牙周炎患者牙周基础治疗前后的微生物组成和多样性进行分析。实验结果显示:拟杆菌门、螺旋体门、互养菌门均与侵袭性牙周炎的致病性有关，而放线菌门和变形菌门与临床症状的改善有关。本研究显示龈下菌群的丰度与差异性和菌群的组成与多样性一样随着牙周基础治疗而改变。进一步的研究会继续扩大样本容量来深入地揭示龈下菌群与牙周的健康和疾病的因果关系。

目录

声明

摘要

中英文缩略词对照表

绪论

1．侵袭性牙周炎病因

2．牙周微生态体系

3．宏基因组学

4．口腔宏基因组研究进展

5．宏基因组学在牙周炎中的研究进展

侵袭性牙周炎患者口腔微生物宏基因组文库的构建

一、研究对象

二、主要材料、试剂及其配置方法

三、主要实验设备

四、实验步骤和方法

侵袭性牙周炎患者口腔微生物多样性分析实验结果及讨论

一、患者临床指标

二、实验室检测

结论

参考文献

致谢