SOS应答对大肠杆菌抗药性与毒力的调控机制

摘要

SOS应答系统普遍存在于细菌，是受到RecA-LexA调控的一种低保真度DNA修复方式。在正常状态下，阻遏蛋白LexA二聚体结合在细菌SOS应答基因的启动子区域，抑制基因表达;当细菌处于应激状态，形成的单链DNA激活启动蛋白RecA，解除LexA的阻遏，SOS应答系统控制的许多关键基因得以表达，产生一系列可能适应环境压力的突变和适应反应。抗生素频繁使用造成了新的生境，病原菌同时面临抗生素和宿主免疫系统的双重抑制作用，必然需要协调和控制其抗药性和毒力。因此，本文构建SOS应答抑制模型，探索抗药性、耐药性与毒力在进化通路上的相关性。
　　一、recA缺失使菌株对恩诺沙星的抗药性和抗药率均明显降低。
　　本文以大肠杆菌ATCC25922和O157∶H7为野生型菌株，通过Red重组系统，敲除两个菌株的recA基因，成功构建了recA缺失菌株ATCC25922/ArecA和O157∶H7/ArecA，利用荧光定量PCR测定SOS应答系统相关基因recA和umuC在恩诺沙星压力下表达量的变化，结果显示recA基因缺失抑制umuC表达，关闭了SOS应答。微量肉汤稀释法药敏试验结果表明，recA缺失菌株对恩诺沙星的MIC值比野生型菌株降低至1/8;梯度平板检测表明，药物诱导ATCC25922/ArecA较野生型菌株不易产生抗药性变异。
　　二、recA缺失对菌株毒力的影响。
　　利用real-time PCR方法研究不同条件下O157∶H7的主要毒力基因stx2和eaeA表达量的变化，恩诺沙星作用能够提高stx2和eaeA的表达，敲除recA后，stx2表达量下调，但eaeA表达量上调;体外细胞试验确定recA缺失能够降低stx2的表达，但却提高eaeA的表达量。
　　三、通过O157∶H7及其recA缺失菌株的转录组分析，探讨SOS应答系统对O157∶H7抗药性和毒力的调控作用。
　　共发现20个可能受SOS调控系统的主要基因，在恩诺沙星处理下表现为表达显著地上调或下调，推测有6个转录子与细菌的耐药性、抗药性有关，2个转录子与与毒力调控相关，3个与核苷酸代谢有关，3个在信号通路的上游。其中粘附素基因eaeA，在转录组分析、荧光定量验证和体外细胞验证中，同时得到印证:此基因由SOS应答系统调控，SOS系统启动导致O157∶H7中粘附素基因的下调表达，使细菌对细胞的粘附力减弱。
　　四、SOS应答抑制剂
　　在以上研究基础上，合成了RecA蛋白抑制剂，它与恩诺沙星联合使用对E.coli生长具有相加抑制作用，荧光定量PCR检测表明RecA抑制剂能够一定程度上抑制恩诺沙星诱导的recA、umuC、eaeA、stx2的表达。

目录

声明

摘要

符号说明

第一章 文献综述

1．1 细菌抗药性毒力及其相关性

1．1．1 细菌抗药性

1．1．2 细菌毒力

1．1．3 细菌抗药性与毒力的相关性

1．2 细菌中的SOS应答系统

1．2．1 SOS应答的发现

1．2．2 SOS应答的诱导信号及启动的一般途径

1．2．3 SOS应答关键基因及其表达产物的功能

1．3 SOS应答系统对抗药性与毒力的调控作用

1．3．1 SOS应答对细菌抗药性表型的影响

1．3．2 SOS应答对细菌毒力的影响

1．4 抑制SOS应答在治疗感染中的应用潜力

1．5 问题与展望

第二章 recA缺失菌株的构建

2．1 材料与方法

2．2 结果与分析

2．2．1 显色培养基的鉴定结果

2．2．2 生理生化鉴定结果

2．2．3 16S rDNA分析

2．2．4 recA基因敲除的鉴定

2．2．5 Escherichia coli生长曲线测定结果

2．3 讨论与结论

2．3．1 讨论

2．3．2 结论

第三章 recA缺失对Escherichia coli抗药性的影响

3．1 材料与方法

3．2 结果与分析

3．2．1 ATCC 25922／ΔrecA和O157∶H7／ΔrecA对恩诺沙星等抗生素的MIC的测定

3．2．2 recA缺失对抗药性变异的影响

3．2．3 SOS应答系统基因recA和umuC表达量测定

3．3 讨论与结论

3．3．1 讨论

3．3．2 结论

第四章 recA缺失对Escherichia coli毒力的影响

4．1 材料与方法

4．2 结果与分析

4．2．1 毒力基因测定

4．2．2 毒力基因表达量测定

4．2．3 细胞粘附试验

4．2．4 细胞毒试验

4．3 讨论与结论

4．3．1 讨论

4．3．2 结论

第五章 RecA抑制剂对SOS应答的影响

5．1 材料与方法

5．2 结果与分析

5．2．1 RecA抑制剂N6-(1-Naphthyl)-ADP的核磁共振鉴定

5．2．2 恩诺沙星与抑制剂联合抑菌作用

5．2．3 SOS相关基因表达量变化

5．3 讨论与结论

5．3．1 讨论

5．3．2 结论

第六章 SOS应答对O157∶H7抗药性和毒力的调控作用

6．1 材料与方法

6．2 结果与分析

6．2．1 测序数据统计

6．2．2 正常生长条件下O157∶H7中recA基因的功能

6．2．3 SOS应答系统对O157∶H7抗药性耐药性和毒力的调控

6．3 讨论与结论

6．3．1 讨论

6．3．2 结论

全文总结

参考文献

致谢

主要发表论文