BDDE交联透明质酸凝胶修饰度的测定

摘要

透明质酸(Hyaluronic acid，HA)是由β-D-葡萄糖醛酸(GlcA)和β-N-乙酰氨基葡萄糖(Gl cNAc)双糖单位通过交替的(1→4)和(1→3)糖苷键连接而成的天然高分子酸性粘多糖。由于良好的生物相容性和独特的理化性质，HA目前被广泛应用于医药及美容领域，交联HA凝胶作为一种新型安全有效的皮下填充材料，已被广大爱美人士和临床医生接受。
　　天然HA由于易被体内的透明质酸酶(hyaluronidase，HAase)降解，在体内保留时间较短，大大限制了HA的临床应用。为了克服HA易被体内HAase降解的不足，提高凝胶的粘弹性，天然HA通常通过交联剂对其进行化学修饰得到交联HA凝胶。修饰度指HA分子被交联剂修饰的程度，作为交联HA凝胶的重要性质参数，修饰度从化学结构基础上直接决定凝胶的多种性质，如吸水膨胀性、粘弹性、体内半衰期等。因此探索可靠的修饰度测定方法，为研究交联HA凝胶的制备工艺和保证其应用安全性有着重要意义。
　　本课题以1，4-丁二醇缩水甘油醚(BDDE，1，4-butanediol diglycidyl ether)为交联剂制备交联HA凝胶，提出与修饰度相关的三个交联参数总修饰度(t-MOD)、悬挂修饰度(p-MOD)和交联修饰度(c-MOD)，并探索了三个交联参数的测定方法。
　　1.交联HA凝胶的制备
　　以BDDE为交联剂，控制交联剂的加入量制备了不同修饰度的交联HA凝胶，通过1H-NMR对交联HA凝胶进行了化学表征;对不同修饰度的HA凝胶的粘弹性、膨胀系数进行了考察;通过扫描电镜SEM对HA凝胶的表面形态进行了表征;利用GC法分析了BDDE在碱液中稳定性。
　　2.交联HA凝胶的酶解研究
　　用一种来源于芽孢杆菌的透明质酸裂解酶HAase-B(能够彻底降解HA为不饱和双糖ΔDiHA)对交联HA凝胶进行了彻底的酶解，采用分子排阻色谱法对交联HA凝胶酶解产物进行了分离制备，并通过1H-NMR和MS对酶解产物进行了定性分析。结果显示，交联HA凝胶的酶解产物中含有五个有BDDE分子链接的寡糖片段，即修饰片段。
　　3.交联HA凝胶修饰度的测定
　　根据面积归一化法，总的修饰度t-MOD由分子排阻色谱图中修饰片段的峰面积计算得到;通过SEC-MS分析，悬挂修饰度(p-MOD)和交联修饰度(c-MOD)由总离子流色谱图(TIC)中悬挂修饰和交联修饰片段的离子峰面积占比计算得到。
　　4.上市产品的修饰度分析
　　利用上述方法对已上市交联HA凝胶产品的修饰度进行了测定，通过对比不同产品交联参数的大小，研究了交联参数与凝胶性质之间的关系。
　　本课题首次利用一种来源于芽孢杆菌的透明质酸酶HAase-B降解交联透明质酸凝胶，通过对酶解产物的定性定量来测得交联HA凝胶修饰度的大小，该方法适用于任意BDDE修饰的交联HA凝胶修饰度的测定。

目录

声明

摘要

符号说明

第一章 绪论

1．透明质酸

1．1 结构

1．2 生理作用

1．3 来源

1．4 性质

1．5 应用

2．交联透明质酸凝胶

2．1 羧基交联

2．2 羟基交联

2．3 HA与交联剂的连接方式

3．修饰度测定方法的研究概况

3．1 间接法

3．2 直接法

4．本课题研究内容

第二章 BDDE交联透明质酸凝胶的制备

1．材料

1．1 试剂

1．2 仪器

2．方法

2．1 HAFG的制备

2．2 结构表征

2．3 吸水膨胀系数测定

2．4 流变学特性的分析

2．5 样品形态表征

2．6 BDDE在碱液中的稳定性试验

3．结果与讨论

3．1 结构表征

3．2 膨胀系数结果

3．3 流变学参数测定结果

3．4 SEM形态表征结果

3．5 BDDE在碱液中的稳定性结果

4．本章小结

第三章 HAFG酶解研究

1．材料

1．1 试剂

1．2 仪器

2．方法

2．1 HAFG的酶解

2．2 酶解产物的SEC分析

2．3 酶解产物的制备与定性分析

3．结果与讨论

3．1 酶解时间的确定

3．2 酶解产物的SEC分析结果

3．3 酶解产物的定性分析

4．本章小结

第四章 HAFG修饰度的测定

1．材料

1．1 试剂

1．2 仪器

2．方法

2．1 t-MOD的测定

2．2 c-MOD和p-MOD的测定

3．结果与讨论

3．1 t-MOD测定结果

3．2 c-MOD和p-MOD的测定

4．本章小结

第五章 上市HAFG产品的修饰度测定

1．材料

1．1 试剂

1．2 仪器

2．方法

2．1 t-MOD的测定

2．2 c-MOD和p-MOD的测定

2．3 抗酶解实验

2．4 粘弹性实验

3．结果与讨论

4．本章小结

总结与展望

1．本论文的研究成果

2．创新与不足

3．展望

附图

参考文献

致谢

硕士期间发表论文