利用猪肾脏脱细胞支架进行肾脏再生的研究

摘要

研究目的：
　　目前终末期肾脏病治疗主要有两种方法:血液透析和肾脏移植。虽然血液透析可以延长终末期肾病患者生命，但血液透析排泄功能差，目前效率仅为10％，且无内分泌功能，患者生活质量、生存时间均不理想。肾脏移植为目前最佳治疗方法，但是供体肾源短缺，严重阻碍了肾脏移植的广泛应用，造成了许多患者在等待器官中死亡，而且移植后的排斥反应、免疫抑制药物的使用带来的副作用也影响了移植物及受者长期存活。
　　再生医学为解决这一问题带来了希望。广义上肾脏再生主要有四种方式:(1)单纯基于细胞进行再生;(2)胚胎后肾移植;(3)人工生物合成材料;(4)生物支架全器官再生。基于细胞进行的肾脏再生，目前研究侧重于干细胞在肾脏损伤中的修复机制。干细胞修复肾脏功能，一般都是通过血液系统进入机体，并没有特异性，并且目前没有试验证实其发生机制。而通过细胞3D培养，如诱导多能干细胞、胚胎干细胞等，在体外能够形成肾小球及肾小管样的结构，但是不能形成完整的肾脏。后肾为成体肾脏的前体，利用胚胎后肾移植到受体大网膜上，后肾可以有新生血管长入受体，并且能够生长至正常肾脏大小。利用异种的动物的后肾进行人体的移植，通过囊胚互补的方式能够解决免疫排斥的问题，但是新生的肾脏血管结构紊乱，无法进行移植，处于腹膜上影响形体以及功能。理论上后肾确实是一个良好的肾脏再生的来源，但是其应用仍然存在较多的问题，比如伦理问题，并且长期存活情况并未有报道。肾脏结构复杂，细胞种类繁多，拥有泌尿及内分泌功能，人工生物合成材料作为支架，难以应用于肾脏。
　　近年来，利用器官脱细胞支架进行全器官再生已然成为研究热点。脱细胞支架由细胞外基质(ECM)构成，是一种具有3D结构和功能的支架网络。ECM可以为细胞提供3D支架，分泌和储存生长因子及细胞因子，调节信号转导。自身ECM因其生物兼容性好、具备细胞生存的必须物质（蛋白质和多糖类）、基质生长因子和细胞因子、完整的血管系统、能够诱导祖细胞向器官特异性细胞分化，因此为器官再生提供了一个良好的支架。近年来尖端科技的发展使研究者开始探索保留自身器官的细胞外基质进行肾脏再生。总之，脱细胞支架为再生提供了一个良好的平台，其保留了细胞生存所不可缺少的微环境。运用脱细胞支架进行器官再生研究已经在心脏、肺脏、肝脏、动脉瓣、肌腱等再生方面有过成功报道。但是去细胞试剂是否破坏了ECM的部分关键结构尚不清楚，并且完全的去细胞化对于器官再生具有非常重要的意义，因为细胞成分残留可能导致新注入的细胞凋亡以及引起炎症反应。因此建立一个良好的器官去细胞化流程至关重要。已有研究显示应用大鼠肾脏细胞对大鼠肾脏脱细胞支架进行再细胞化，获得了有功能可移植的肾脏。但是其肾脏体积较小，距离临床应用仍有很大距离。猪肾脏大小、解剖学与人类相近，并具有分支型、迷走型肾动脉出现率低的优点，从解剖学角度看猪肾脏比较符合异种移植的要求。
　　针对上述问题，我们拟用猪为实验动物，制作猪肾脏脱细胞支架，通过相关鉴定，应用胚胎干细胞对猪肾脏脱细胞支架进行再细胞化，为获得有功能可移植的大动物肾脏，为将来对人体肾脏进行肾脏组织工程研究提供科研依据。
　　研究方法：
　　1.制作猪肾脏脱细胞支架。以家猪为实验对象，将猪麻醉后取出肾脏。应用自制肾脏灌流设备连接灌注液与猪肾动脉，立刻使用磷酸钠缓冲液(PBS)进行冲洗，以冲出肾脏内血液，防止血凝发生。然后以8ml/min速度向猪肾灌注0.5％十二烷基磺酸钠(SDS)以及1％的Triton-x100，对猪肾脏进行去细胞化，待肾脏变为白色稍微透明时，停止灌注，再用PBS冲洗4天，将SDS冲洗干净，获得猪肾脏脱细胞支架。
　　2.猪肾脏脱细胞支架的鉴定。应用免疫组化、免疫荧光、Elisa检测、DNA定量分析、聚合酶链式反应以及胶原含量测定等方法做相关鉴定。Masson染色用于鉴定脱细胞前后细胞成分去除是否彻底以及胶原保留情况;免疫荧光用于鉴定Ⅳ型胶原和层黏连蛋白;血管造影鉴定血管系统保留完整情况;DNA及胶原检测脱细胞前后DNA及胶原含量;Elisa检测脱细胞前后部分细胞因子的变化;聚合酶链式反应方法测定PERV病毒;分子生物学方法测定有无脱细胞液体残留，最终确定标准的制定猪肾脏脱细胞支架的方法。
　　3.胚胎干细胞的培养及鉴定。我们经过小鼠胚胎干细胞的培养，应用免疫荧光方法对OCT4、SOX2以及NANOG三种干细胞标志物进行鉴定，确定其干细胞特性。应用于细胞大量扩增技术对胚胎干细胞进行扩增，以准备用于对脱细胞支架进行细胞种植。
　　4.细胞种植。将胚胎干细胞大量扩增后制备细胞悬液，浓度约5×107/ml，共计10ml。利用28G套管针将其多点穿刺注入肾脏内部。每24h注射一次，共计三次，最后一次注射后静置24h，在每次注射后，肾脏放置于细胞培养环境中，温度37℃，气体为5％CO2和95％空气混合气体。
　　5.体外器官培养。肾脏注射细胞完毕后，应用相关培养基进行连续灌注培养，培养基中先通过5％CO2和95％空气混合气体，气体经过清洁过滤。整个灌注培养系统置于37℃的清洁环境中，连续培养十天，然后取组织固定后经过HE染色以及免疫荧光进行鉴定。
　　研究结果：
　　1.在大体形态方面，猪肾脏经过30h的5％SDS及1％Triton-X100的连续灌注冲洗，逐渐变为稍透明的白色肾脏，获得猪肾脏脱细胞支架。
　　2.通过Masson鉴定发现细胞成分已经完全去掉，仅剩蓝色的胶原成分;DNA定量分析表明仅剩余少量DNA成分，低于正常含量的5％，胶原含量以及部分细胞因子含量脱细胞前后无差异;免疫荧光检测显示Ⅳ型胶原及层粘连蛋白在脱细胞后保留完整。通过血管造影检查发现，造影剂从肾动脉进入后逐级向各级血管分支，最后从血管末梢渗出，整个过程中在血管干道没有造影剂漏出，证明所做支架血管完整性良好。通过聚合酶链式反应检测猪肾脏内源性反转录病毒(PERV)为阴性，不存在感染种植细胞的可能。
　　3.胚胎干细胞生长较好，在连续传代培养后，依然保持良好的克隆状态，边缘较为光滑。通过免疫荧光测定，干细胞相关marker: OCT4、SOX2及NANOG表达较好，证明经过我们的大量扩增之后，胚胎干细胞依然保持良好的干细胞特性。
　　4.细胞种植过程顺利，细胞贴附良好。通过自制大动物器官培养装置连续培养后，通过HE染色及DAPI免疫荧光测定显示有细胞在肾脏支架内生长，证明经过连续的器官灌注培养，能够较好的保持脱细胞支架内贴附细胞的营养供应。
　　研究结论：
　　1.我们建立了一套快速、有效的大动物脱细胞设备及支架制备流程，通过0.5％的SDS及1％Triton结合灌注，能够制备结构与功能良好的猪肾脏脱细胞支架。
　　2.所制备猪肾脏脱细胞支架能够完整保留正常肾脏的3D结构、血管系统以及集合系统，相关的细胞外基质蛋白及细胞因子保留较好，能够促进干细胞的贴附与增殖。
　　3.通过多点穿刺进行细胞种植，建立了简易有效的的大动物脱细胞支架细胞种植流程，干细胞能够较好的贴附与增殖，为以后进行大动物肾脏脱细胞支架细胞种植提供了良好的基础.

目录

声明

摘要

符号说明

前言

第一部分 猪肾脏脱细胞支架的制备及鉴定

1．材料

2．方法

3 统计学分析

4 结果

5 讨论

6 结论

第二部分 细胞种植与相关鉴定

1 资料与方法

2 结果

3 讨论

4 结论

附图

参考文献

文献综述

致谢

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