癫痫持续状态模型中海马神经元损伤及其可能机制的研究

摘要

氯化锂-匹罗卡品诱导的癫痫持续状态(status epilepticus，SE)可以引起几个脑区神经元的严重病变，其中以海马区损伤最为显著。许多研究认为海马神经元损伤可能与谷氨酸α-氨基-3-羟基-5-甲基异恶唑-4-丙酸(AMPA)受体介导的兴奋性神经毒性有关。但成年大鼠海马AMPA受体(AMPAR)主要由第二亚单位(GluR2)组成，对钙离子的渗透性较低，难以造成钙离子内流引起钙超载而致神经元损伤。AMPAR激活是怎样引起神经元损伤的机制尚不清楚。
　　近有研究发现GluR2与甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)形成的蛋白复合物在脑缺血模型中上调，引起神经元变性。而使用破坏该复合物耦合作用的干扰肽可以明显减少模型中的神经元病变，保护神经元损伤。
　　目的：
　　GluR2/GAPDH在SE中的耦合变化现象尚未见报道，因此，本研究通过建立氯化锂-匹罗卡品诱导的SE模型，研究海马神经元的损伤、GluR2蛋白表达变化以及GluR2/GAPDH蛋白复合物的耦合变化，探讨SE中海马神经元损伤可能存在的机制，从而为指导癫痫持续状态患者的临床治疗提供新靶点，进而减轻癫痫持续状态患者的社会、心理负担，甚至为治愈疾病提供新线索。
　　方法：
　　1.实验动物及研究方案:健康雄性6-8周Wistar大鼠82只，体重200-240 g，饲养温度23～25℃，自由进水与饮食。按照随机数字表法将大鼠分为2组:正常对照组(n=20)，SE组（n=62）。SE组又随机分为SE后1h、6h、24 h、72 h、7d组。随机选择正常对照及SE后不同时间点大鼠各6只，制备海马石蜡切片后进行Nissl及原位末端标记(TUNEL)染色;随机选择正常对照及SE后1h、6h、24 h、72 h、7d大鼠各6只，提取海马组织蛋白后进行Western blot实验。根据海马神经元损伤及GluR2表达变化的分析，选择上述研究内容变化相对最明显的SE后某时间点大鼠进行免疫共沉淀。
　　2.SE模型制备及入组标准:Wistar大鼠腹腔注射氯化锂，18～24 h后腹腔注射盐酸匹罗卡品诱发癫痫发作，出现SE后60～90 min，腹腔注射地西泮解除抽搐。痫性发作行为学评价根据Racine分级标准分为5级，其中4级和5级为全身强直阵挛发作。诱发成功即出现4级以上发作行为。
　　3.组织病理学取材:正常大鼠以及成功诱导SE发作后不同时间点大鼠分批处死，每组随机选择6只进行心脏灌流。10％水合氯醛麻醉大鼠后进行心脏灌流、固定、脱水、透明、石蜡包埋，石蜡切片机连续冠状切片，进行Nissl染色及TUNEL染色观察海马CA1、CA3区形态学变化以及凋亡情况。
　　4.Nissl染色:将已制备好的各组石蜡切片常规脱蜡至水，37℃水浴箱中以0.5％硫瑾孵育10 min，95％乙醇分化至背景无色，常规脱水、透明、封片。每隔5张冠状海马切片取1个，共取3个染色。染色结果在×400倍显微镜下计数CA1区、CA3区100μm×100μm区域内的神经元数量。
　　5.TUNEL染色:取已制备好的各组石蜡切片，常规脱蜡至水，去除内源性过氧化物酶，蛋白酶K通透处理。TUNEL1号2号混合液37℃反应1h，阴性对照组用PBS代替1号液，其他相同。PBS清洗后加50 ul TUNEL3号液37℃湿盒孵育30 min。PBS清洗，DAB显色，苏木精复染。常规脱水、透明、中性树胶封片。实验中使用的是与Nissl染色相邻的海马切片，染色后胞核可见棕黄色颗粒，此为阳性细胞。光镜下分析染色结果，每组各选CA1、CA3区阳性细胞最明显的3个×400高倍视野，计算出阳性细胞数，取平均值。
　　6.Western blot:正常及SE后不同时间点大鼠麻醉去除颅骨，快速于冰袋中取海马，提取总蛋白并测定蛋白浓度，电泳，转膜，封闭，一抗孵育，二抗孵育。以β-action为内参调节上样误差，以目的蛋白（GluR2）/内参蛋白(β-action)的灰度值作为检测蛋白的相对表达量。
　　7.免疫共沉淀:正常及SE后72 h大鼠同时在冰上快速取海马，提取蛋白，Protein A/G plus agarose去除非特异性结合蛋白。目的蛋白抗体及对照抗体孵育裂解蛋白，离心去掉非目的蛋白，进行Western blot步骤，将SE组中GAPDH与GluR2的灰度值之比与对照组中GAPDH与GluR2的灰度值之比进行比较，得出GAPDH/GluR2的耦合变化。
　　8.统计分析使用SPSS17.0软件，计量资料采用(x)±s表示，两组数据间的比较采用t检验，各组数据间的差异采用单因素方差分析。
　　结果：
　　1.SE发生后各时间点海马神经细胞数量显著减少，与对照组存活神经细胞数相比，差异有统计学意义（P＜0.05)。
　　2.SE发生后24 h开始凋亡细胞数量增加，到72 h凋亡达到最高点，且各组与对照组凋亡神经元数相比，差异有统计学意义(P＜0.01)。
　　3.SE发生后24 h、72 h、7 d GluR2相对表达量减少，且SE后72 h GluR2减少最明显，差异均具有统计学意义(P＜0.01）。
　　4.与对照组比较，SE发生后72 h时GluR2/GAPDH蛋白复合物耦合增加，差异有统计学意义(P＜0.05）。
　　结论：
　　1.SE可导致海马CA1区、CA3区神经元损伤。
　　2.海马GluR2表达降低及GluR2/GAPDH蛋白复合物耦合增加可能是癫痫持续状态大鼠神经元损伤的机制之一。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

材料与方法

1．材料

2．方法

结果

1．氯化锂-匹罗卡品诱导的SE大鼠模型

2．PILO诱导的SE大鼠中海马形态学改变

3．SE后不同时间点海马神经元细胞凋亡的动态变化

4．SE后不同时间点海马GluR2表达的动态变化

5．SE后72h海马GluR2／GAPDH的耦合变化情况

讨论

结论

附图表

参考文献

综述

致谢

攻读学位期间发表的论文