Treg输注移植通过抑制神经炎症对SAH小鼠脑组织的保护作用研究

摘要

目的:蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage，SAH)是常见的脑组织出血性病变，因其致死致残率高，且存活者多预后不良，造成患者生活质量下降。研究证实SAH患者脑血管痉挛(cerebralvasospasm，CVS)和早期脑损伤(Early brain injury，EBI)的严重程度，与不良预后相关。因此，非常有必要研制新型药物，控制SAH后早期炎性免疫反应，减轻EBI和CVS的致病性，减轻患者的痛苦。有研究证实，调节性T细胞(CD4+CD25+regulatory T cell，Treg)在抑制脑梗死再灌注小鼠脑组织的损伤方面发挥内源性保护作用。那么，同样做为颅内缺血缺氧性损伤，调节性T细胞能否在SAH后的炎性免疫反应中发挥调节作用呢？
　　我们利用线栓刺破法制作小鼠SAH模型，从小鼠脾、淋巴结中提取并体外扩增调节性T细胞，输入SAH小鼠体内，通过小鼠神经功能学的评价和各项实验数据的分析，探讨Treg对SAH小鼠脑保护作用的疗效。
　　为验证体外细胞实验得到的结论，能否在动物模型中复制，并进一步探讨Treg对体外BV2及体内脑组织保护作用的机制和作用方式，我们通过脂多糖激活BV2活化的体外细胞模型，模拟体内小鼠脑组织SAH缺血缺氧的病理过程，从小鼠脾脏及淋巴结中提取并体外扩增调节性T细胞，与脂多糖激活的BV2共培养，旨在通过Treg与BV2共培养，验证Treg对体外BV2的保护作用机制。我们分别从体外细胞培养和动物在体实验两个角度，从细胞整体水平、蛋白水平和mRNA三个水平共同研究，多方位多角度综合探讨Treg发挥疗效的机制。
　　方法:通过免疫磁珠双选的方法，提取小鼠脾脏及淋巴结Treg。颈内动脉线栓刺破法制作小鼠SAH模型，随机分为Sham组、SAH+PBS组、SAH+SP(Splenocyte，脾细胞)组、SAH+Treg组，经股静脉输注CD4+CD25+Treg，造模成功后48h，记录脑血流量及各组动物行为学指标;分别制备石蜡、冰冻切片，通过不同染色法研究脑细胞形态及阳性细胞的分布情况，验证Treg输注移植对SAH小鼠脑组织的保护作用。
　　脂多糖诱导体外BV2激活，Treg与激活的BV2共培养，采用MTT法检测体外BV2的活性;利用硝酸还原酶法和ELISA法检测炎性因子TNF-α、IL-6、NO、IL-10的含量;采用尼罗红微球吞噬实验，验证Treg对LPS诱导BV2吞噬情况的调节作用。免疫荧光双染及免疫荧光三染法，标记体外BV2和体内SAH小鼠脑组织不同极化状态M1、M2期阳性细胞表达的情况;采用实时荧光定量PCR(RT-PCR)法分别检测体外BV2和SAH小鼠脑组织M1、M2期标志物mRNA水平的表达量;采用Western blot法分别检测体外小胶质细胞和SAH小鼠脑组织内相关信号通道TLR4/p-NFκB、p-P38/P-ERK1/2的蛋白表达量。通过多方位多角度的综合研究，深入探讨Treg对BV2和SAH小鼠脑组织保护作用的机制。
　　结果:Treg静脉输注移植，SAH后小鼠死亡率下降，各项生命体征及神经功能学表现情况明显好转，神经功能学评分提高，脑组织血流量改善，小鼠脑水肿情况减轻，脑实质内微动脉及基底动脉痉挛程度减轻，血管内皮细胞受损程度减轻，小鼠脑组织神经元凋亡数量减少，损伤程度降低。
　　Treg与LPS激活的体外BV2共培养，炎性刺激因子含量明显减少，抑制因子IL-10含量增加，同时，BV2在吞噬过程中吞掉了更多的微球，Treg对LPS激活的BV2有明显保护作用。免疫荧光染色显示，Treg输注移植，体外小胶质细胞和SAH小鼠脑组织M1期标记物表达减少，M2期标记物表达上调。RT-PCR结果显示，Treg输注移植，体外小胶质细胞和SAH小鼠脑组织M1期标记物mRNA水平的表达减少，M2期标志物mRNA水平的表达上调。Western blot结果显示，Treg输注移植，体外BV2和SAH小鼠脑组织内炎性信号通路TLR4、p-NF-κB、p-P38、p-ERK1/2的蛋白表达量明显减少。
　　结论:
　　1、Treg输注移植能够减轻SAH小鼠早期死亡率，改善48h局部脑血流量，有效缓解SAH后血脑屏障的破坏程度，维护脑实质内血管形态的完整性，减轻BA痉挛程度，显著减轻小鼠皮层及海马神经元损伤的程度，减轻脑组织细胞过度凋亡的程度，有助于改善SAH后小鼠神经功能学水平，促进神经元的修复，提高SAH后小鼠生活质量。
　　2、Treg与LPS激活的BV2共培养，细胞培养液炎性刺激因子的含量减少，抑制因子的含量增加，BV2的吞噬作用增强。
　　3、Treg输注治疗可通过减少M1极化状态标记物mRNA水平的表达，抑制小胶质细胞M1极化;增加M2极化状态标记物mRNA水平的表达，促进小胶质细胞M2极化，从而抑制炎性细胞因子的分泌，发挥脑组织的保护功效。
　　4、Treg可能通过抑制炎性信号通路TLR4/p-NF-κB、p-P38/p-ERK1/2的激活，减少炎性刺激因子的表达。
　　本实验创新性地将RT-PCR法和免疫荧光染色法相结合，同时研究Treg对体外BV2和动物体内小胶质细胞不同极化状态的调节作用，通过体外细胞水平的实验与在体动物模型的实验相结合，将动物的行为学观察与细胞分子水平的机制研究相结合，多方面多角度充分地探讨了调节性T细胞对组织的保护疗效。本实验证明，Treg对体外BV2和SAH小鼠脑组织有明显的保护作用。然而，动物模型水平得出的结论，与临床人体的实际应用仍有较大距离，细胞作为一种生物学活性物质，不能像化学药物一样稳定，其保存及运输等方面存在的问题是临床应用的重要瓶颈。另外，人体活体细胞的移植，尚存在伦理及排异等多方面的问题有待进一步研究和解决。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

参考文献

第一部分 Treg输注移植对SAH小鼠脑组织的保护作用

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

附图

参考文献

第二部分 Treg输注移植通过调节小胶质细胞介导的神经炎症对SAH小鼠发挥神经保护作用的机制研究

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

附图

参考文献

综述 The Mechanisms of Regulatory T-cells

致谢

攻读学位期间发表论文

学位论文评阅及答辩情况表

外文文章