分子表型异质与化疗反应的关系和mir-424靶向调控CHK1参与乳腺癌进展的研究

摘要

本文主要从以下几个部分展开论述：
　　第一部分 乳腺癌分子表型异质与化疗反应的关系研究
　　目的：
　　乳腺癌是一组具有分子及生物学异质性的肿瘤性疾病，肿瘤异质性是困扰临床治疗的难题。ER、PR、HER2、Ki-67等分子标记物的检测已经成为乳腺癌患者临床诊疗过程中的常规方法。分子标记物的变化，有助于分析肿瘤细胞对化疗药物的反应性，以及调整化疗方案，指导用药等。本次研究利用新辅助化疗前后对照标本，检测化疗前后分子标记物的表达变化，并且探讨了肿瘤大小和淋巴结转移情况等临床病理参数与化疗前后分子表型改变的关联。同时，我们还重点观察了肿瘤异质性克隆的化疗反应性差别，探讨HER2异质性对化疗反应的影响。
　　方法：
　　1.收集山东大学齐鲁医院2011年-2013年之间107例接收至少3个周期新辅助化疗的浸润性乳腺癌标本，包括化疗前粗针活检和化疗后手术切除肿瘤标本，完善病例的相关临床病理资料。
　　2.将107例浸润性乳腺癌病例蜡块分别切成4 u m薄片，免疫组化检测新辅助化疗前活检标本和化疗后手术切除肿瘤标本中ER、PR、HER2、Ki-67的表达情况。荧光原位杂交技术检测HER2基因扩增情况。
　　3.ER和PR阳性表达参照H-score和ASCO/CAP指南(≥1＜)两种方法进行半定量和定性评判。HER2阳性判读参照HercepTest标准。采用14＜作为Ki-67阳性细胞数百分比的cut-off值。
　　4.HER2基因异质性判断:2位病理医师采用双盲法，选取至少3个HER2基因有差别的肿瘤区域，每个区域计数至少20个肿瘤细胞，如果所有区域判读结果一致，则认为没有异质性，否则，则判定为HER2异质性。
　　5.所有肿瘤根据活检的受体表达情况和增值指数进行分子分型: luminalA亚型(ER+/PR+/HER2-，Ki67＜14＜)，luminalB亚型(ER+/PR+/HER2-，Ki67≥14＜)，HER2扩增亚型(ER-/PR-/HER2+)，三阴性亚型(ER-/PR-/HER2)，以及luminal-HER2亚型(ER+/PR+/HER2+)。
　　结果：
　　1.乳腺癌新辅助化疗前后标本中，ER、PR、HER2化疗后表达改变的发生率分别为14＜(15/107)，24.3＜(26/107)和4.7＜(5/107)。化疗后PR(P=0.013)和Ki-67(P=0.000)的表达水平明显下调。
　　2.通过分析乳腺癌不同分子亚型化疗前后分子标记物的表达变化发现，三阴性乳腺癌化疗前后标记物ER、PR、HER2表达无变化，luminal B和luminal-HER2两种亚型肿瘤出现较多分子表型改变。
　　3.肿瘤体积大和腋窝淋巴结发生转移的病例更容易出现化疗后分子标记物表达的变化，提示乳腺癌在进展过程中有可能获得更多的异质性肿瘤细胞，从而导致化疗前后表达的不一致。
　　4.同一肿瘤内部存在分子表型的异质性，不同分子克隆的肿瘤细胞表现出对化疗药物不同的反应性。
　　结论：
　　1.肿瘤异质性是活检标本和术后手术切除标本分子检测结果不一致的原因之一。
　　2.luminal B和luminal-HER2两型肿瘤相对于其他类型的肿瘤表现出化疗后更多的分子表型改变，提示有可能是异质性更显著的肿瘤类型。
　　3.分子表型异质性肿瘤细胞表现出对化疗药物不同的反应性，HER2扩增异质性判读标准急需进一步明确。
　　第二部 miR-424靶向调控CHK1参与乳腺癌进展的研究
　　目的：
　　Chk1（checkPoint kinase1，细胞周期检测点激酶1）是细胞G2/M期重要的检查点蛋白，在乳腺癌，尤其是三阴性乳腺癌中存在高水平表达，并与肿瘤放化疗抵抗密切相关。我们前期研究发现，同一肿瘤相对于新辅助化疗前，Chk1蛋白表达在化疗后显著升高，并且与化疗耐药密切相关。同时，我们FISH研究发现，CHK1基因并无扩增或多倍体情况。因此，我们推测转录后调控可能是Chk1蛋白过表达的原因。生物信息学预测miR-424可能靶向下调Chk1蛋白的表达。本研究首次探讨在乳腺癌细胞系MDA-MB-231中，miR-424对CHK1的靶向调控作用，以及对细胞周期、细胞凋亡和迁移浸润的影响。本研究将会为Chk1蛋白高表达引起的乳腺癌耐药提供新的研究靶点。在未来的实验中，我们将会进一步探讨miR-424在提高肿瘤细胞化疗敏感性中的靶点调控机制。
　　方法：
　　1、荧光素酶实验验证CHK1是miR-424直接调控的靶基因。
　　2、RT-qPCR检测转染后各组癌细胞中Chk1 mRNA的表达情况;Western Blot检测转染后各组癌细胞中Chk1蛋白的表达情况。
　　3、采用实时定量荧光PCR技术检测50例乳腺癌组织和15例癌旁组织中miR-424的表达情况。
　　4、培养乳腺癌细胞系MDA-MB-231，瞬时转染miR-424 mimic、miR-424inhibitor及negative control，流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡变化。transwell检测转染后癌细胞的迁移和浸润能力。
　　结果：
　　1、荧光素酶实验结果显示，miR-424 mimic转染组的荧光值较对照组明显下调(P＜0.05)，验证了CHK1是miR-424的直接靶基因之一。
　　2、RT-qPCR检测结果显示， miR-424mimic、miR-424inhibitor转染组Chk1mRNA的表达水平较NC组没有明显改变。Western Blot检测结果显示，miR-424mimic转染组Chk1蛋白表达水平较NC组下调，miR-424inhibitor转染组Chk1蛋白表达水平较NC组升高，差异均具有统计学意义(P＜0.05)。
　　3、实时定量荧光PCR结果显示，与15例癌旁组织比较，50例乳腺癌组织中miR-424表达水平下调接近50＜，差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　4、流式细胞术检测细胞周期发现miR-424可以解除癌细胞G2/M期阻滞，miR-424过表达组细胞周期G2/M率(13.97＜±0.81＜)较对照组(20.33＜±1.99＜)显著降低(P＜0.05，P=0.02);流式细胞术检测细胞凋亡表明，miR-424能诱导乳腺癌细胞的凋亡。miR-424mimic转染组的凋亡率(18.23±1.29＜)较对照组(8.57±0.52＜)升高了2.13倍(P＜0.05);transwell检测结果显示，miR-424对乳腺癌细胞的迁移和浸润能力有着明显的抑制作用(P＜0.05)。
　　结论：
　　1、CHK1是miR-424的直接靶基因之一。
　　2、miR-424可通过调控基因CHK1表达解除乳腺癌细胞G2/M期阻滞，促进凋亡和抑制迁移浸润。

目录

声明

第一部分 乳腺癌分子表型异质与化疗反应的关系研究

摘要

符号说明

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

第二部 miR-424靶向调控CHK1参与乳腺癌进展的研究

摘要

符号说明

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表的论文