原癌基因AGR2介导前列腺癌耐药与侵袭转移的机制及逆转耐药的应对策略

摘要

前列腺癌（Prostate cancer，PCa）是严重威胁中老年男性生命健康的恶性肿瘤，在北美其死亡率仅次于肺癌。随着人口老龄化、生活环境和饮食结构的改变等，我国PCa发病率迅猛增长，且中晚期患者的比例远大于国外，死亡率在亚洲国家仅次于越南，位居第二。由于PCa恶性程度高，临床缺乏有效的治疗方案，预后差，因此针对其恶性表型的机制及其治疗策略的研究一直倍受关注。
　　作为一种激素依赖性肿瘤，PCa的临床首选方案是内分泌治疗。但绝大多数PCa患者在接受治疗后1-2年，肿瘤复发并发展成为抵抗内分泌治疗且伴随远端侵袭转移的去势抵抗性前列腺癌(Castration-resistant prostate cancer，CRPC)。化疗是临床上应对CRPC的主要手段:除米托蒽醌、磷雌氮芥等，微管靶向药物多西紫杉醇(Docetaxel，Doc)、卡巴他赛(Cabazitaxel)也是一线治疗方案的常用药物，此类药物作为天然产物紫杉烷的衍生物，已被证实是目前唯一能够有效延长PCa患者生存期的化疗药。但统计数据显示，有50％左右的CRPC患者对多西紫杉醇先天不敏感、产生耐受，或者经药物治疗后产生较强的毒副作用;同时，与其它抗肿瘤药物相类似，经多西紫杉醇治疗后会诱发肿瘤多药耐药（Multidrug resistance，MDR），导致化疗失败。多西紫杉醇诱导的MDR机制比较复杂，主要包括:药泵蛋白如P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)过度表达、微管结构功能改变、凋亡机制变化、MicoRNA的调节作用、耐药细胞株上皮间充质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT)等。针对多西紫杉醇MDR的逆转策略也在积极的探索，多有报道，如卡巴他赛对P-gp的亲和力较低，可作为经多西紫杉醇治疗后P-gp介导的MDR逆转剂，取得了良好的临床效果。但PCa的MDR是多信号、多基因并存的机制，单一耐药靶点的逆转依然具有局限性，因此深入分析PCa恶性表型的发生机制、寻找新的治疗策略仍刻不容缓。
　　本课题组前期基于癌症基因图谱(The Cancer Genome Atlas，TCGA)计划所提供的基因组测序数据，分析与CRPC的分期、侵袭转移、药物耐受等恶性表型密切相关的基因，筛选出前梯度同源蛋白2(Anterior gradient protein2homolog，AGR2)为候选基因之一。AGR2与肿瘤的发生和发展均密切相关，研究报道较多。我们前期研究也发现AGR2在中国汉族人群前列腺癌病人癌组织中高表达，其高表达量与病人低生存率密切相关。并且AGR2下调可诱导前列腺癌细胞衰老，而衰老也与肿瘤的发生和耐药等过程有关。近年来，AGR2与肿瘤耐药的关联研究初露端倪:AGR2高表达能够增强乳腺癌、胰腺癌、法特壶腹癌、肺癌对顺铂、多柔比星及吉西他滨等传统化疗药物的耐受;雌激素拮抗剂他莫昔芬可诱导乳腺癌AGR2高表达，从而抵抗他莫昔芬治疗而产生耐药。与上述肿瘤不同，内分泌治疗失败的CRPC患者血清AGR2的水平与激素敏感性前列腺癌患者相比较低，激素非依赖性前列腺癌耐紫杉醇细胞株(PC3-Rx)中AGR2的表达显著下调;而干扰PC3细胞中AGR2的表达，会增加其对紫杉醇的耐受。上述结果显示，AGR2表达下调与前列腺癌细胞的紫杉醇耐药有关，但机制尚不明确。同时我们利用多西紫杉醇诱导PCa细胞PC3（恶性程度高、且激素非依赖型的PCa细胞），构建多药耐药细胞PC3/Doc，通过分析PC3/Doc细胞基因表达差异谱芯片数据，发现AGR2表达下调显著。因此，本论文将继续分析AGR2在PCa恶性表型中的作用，重点分析AGR2与PCa的侵袭转移、多药耐药的关系:1）多西紫杉醇下调AGR2的机制;2）AGR2下调与PCa的MDR相关性及其应对策略;3）AGR2促进PCa侵袭转移的机制;4)鉴于多西紫杉醇属二萜化合物，我们同样对新的贝壳杉烷型二萜类天然化合物进行抗肿瘤活性筛选，并分析AGR2对新的活性二萜化合物的应答，以期发现能够逆转AGR2介导的MDR的新化合物，为新药研发开阔思路。
　　第一部分 AGR2表达下调促进前列腺癌细胞对多西紫杉醇耐药及逆转剂研究
　　我们通过生物信息学分析AGR2参与或介导的生物学功能，结果显示，除作用细胞周期与增殖等信号外，泛素-蛋白酶体通路与其相关性最高。泛素-蛋白酶体系统(Ubiquitin-proteasome syste，UPS)是真核生物细胞内重要的蛋白质质量控制体系之一。
　　一、多西紫杉醇通过诱导自噬促进AGR2的蛋白降解
　　1.多西紫杉醇下调AGR2的表达:前列腺癌细胞PC3经多西紫杉醇处理后，细胞内AGR2的蛋白水平随作用时间的延长而持续降低。
　　2.多西紫杉醇诱导的耐药细胞及化疗后病人血样中AGR2的表达显著降低:Western blotting结果表明:多西紫杉醇诱导的多药耐药PC3/Doc细胞株中AGR2的表达下调;而紫杉醇诱导的多药耐药肺癌细胞H460/RT中AGR2的表达也显著下调。
　　二、低表达AGR2降低细胞对多西紫杉醇的敏感性
　　PC3细胞下调AGR2产生耐药:MTT实验结果表明，在AGR2表达较高的PC3细胞中下调AGR2，与对照细胞相比，AGR2下调后PC3细胞对多西紫杉醇的敏感性降低。
　　第二部分 AGR2促进血管新生与诱导EMT而增强前列腺癌侵袭转移
　　本论文就AGR2促进前列腺癌侵袭转移的机制进行研究，从而为AGR2作为前列腺癌治疗的靶点提供更充分的依据。
　　一、AGR2促进前列腺癌侵袭转移
　　1.细胞实验表明AGR2促进前列腺癌细胞侵袭转移:我们通过划痕实验与Transwell实验分析AGR2对细胞迁移和侵袭能力的影响。
　　2.体内实验验证AGR2促进前列腺癌侵袭转移:通过裸鼠原位种植以及活体动物成像技术，我们分析AGR2表达升高对肿瘤的生长、侵袭转移能力的影响。
　　二、AGR2通过上调VEGFR2表达，激活VEGF通路促进血管新生而促进前列腺癌的侵袭转移
　　AGR2促进瘤组织血管生成:通过观察、对比动物实验瘤组织发现，过表达AGR2的瘤块组织较对照组血管丰富，颜色鲜红，提示AGR2可能具有促进血管新生的作用。
　　第三部分 AGR2对新型贝壳杉烷型二萜化合物的应答及化合物抗肿瘤活性分析
　　一、JA和JB促进前列腺癌细胞增殖、促进细胞凋亡
　　JA和JB抑制前列腺癌细胞PC3增殖。MTT结果显示JA和JB对多种肿瘤细胞杀伤活性较高，且对永生化正常前列腺上皮细胞毒性低于肿瘤细胞。实时监测生长曲线显示JA和JB对PC3细胞的增殖具有较强的抑制作用，且作用强度呈浓度时间依赖性。
　　二、AGR2对贝壳杉烷型二萜化合物的应答
　　化合物JA和JB对AGR2表达的影响:western blotting结果显示化合物JA作用PCa细胞PC32h时，AGR2表达开始出现下调，并随作用时间的延长，AGR2表达持续降低;而化合物JB，对AGR2蛋白的表达下调作用不显著。
　　三、JA和JB增加ROS诱导PC3细胞DNA与线粒体损伤
　　化合物JA减少PC3细胞内还原性谷胱甘与总谷胱甘肽的含量，且呈时间依赖性。应用巯基探针利用免疫荧光技术研究发现化合物JA和JB均能减少PCa细胞株PC3和DU145细胞内游离巯基的含量。
　　四、JA和JB分别通过下调c-Myc和活化JNK通路阻滞PC3细胞于不同周期
　　1.JA和JB阻滞PC3细胞于不同周期。细胞周期分析结果显示，不同浓度JA(0，0.75，1.5μM)阻滞PC3细胞在G0/G1期的比例依次为56.74％，69.63％和76.67％;
　　2.JA与JB分别通过下调c-Myc和活化JNK通路阻滞PC3细胞于不同周期。Western blotting实验结果显示，PC3细胞经JA处理后，癌基因c-Myc表达量显著下降，通过转染技术过表达细胞内c-Myc后，JA对PC3细胞G0/G1期阻滞作用由74.54％到81.23％，逆转阻滞作用由72.03％到75.43％。
　　第四部分 结论及创新点及不足之处
　　一、结论
　　1.多西紫杉醇可通过诱导PCa细胞自噬促进AGR2蛋白降解。
　　2.低表达AGR2可诱导PCa产生多西紫杉醇耐药。
　　3.AGR2可通过促进血管新生与上皮间质转化促进前列腺癌侵袭转移。
　　4.贝壳杉烷型二帖类化合物通过ROS途径引起DNA损伤及其周期阻滞从而诱导前列腺癌细胞凋亡。
　　二、创新点
　　1.首次报道AGR2可抑制蛋白酶体活性，并发现对多西紫杉醇耐受的PCa细胞对蛋白酶体抑制剂敏感。
　　2.首次报道多西紫杉醇可通过诱导自噬促进AGR2蛋白降解。
　　3.首次报道AGR2可上调VEGFR2的表达，激活VEGF通路，促进PCa血管新生，增强PCa侵袭转移。
　　三、不足之处
　　1.AGR2抑制蛋白酶体活性的机制尚未研究清楚，但是与之相关的研究工作已经开展。
　　2.AGR2可分泌到胞外，胞外蛋白对VEGFR2的相互作用尚不清楚，但是已经构建了AGR2内质网定位信号氨基酸序列突变的质粒进行下一步研究。
　　3.化合物JB与多西紫杉醇对PCa的疗效的对比工作尚未进行研究。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

第一部分 AGR2表达下调促进前列腺癌细胞对多西紫杉醇耐药及逆转剂研究

前言

1．实验材料

2．实验方法

3 实验结果

4．讨论

小结

第二部分 AGR2通过促进血管新生与诱导EMT而增强前列腺癌侵袭转移

前言

1．实验材料

2．实验方法

3．实验结果

4．讨论

小结

第三部分 AGR2对新型贝壳杉烷二萜化合物的应答及化合物抗肿瘤活性分析

前言

1．实验材料

2．实验方法

3 实验结果

4 讨论

小结

参考文献

致谢

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